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【研究背景】植物全基因组关联性分析表明许多重要的农艺性状与单碱基的突变密切相关。通常单碱基的变异会导致氨基酸替换,从而导致基因功能发生改变;单个碱基的突变也会改变基因调控作用位点,从而影响其表达。TILING作为传统筛选定点突变的方法,耗时耗力且所鉴别的点突变经常受数目和种类的限制;而目前基于基因组编辑技术的同源重组(HR)介导的基因定点替换由于其发生频率极低以及供体DNA导入较为困难,使其应用受到很大的限制;【材料与方法】本研究以小麦,水稻及玉米为研究材料,利用nCas9与胞嘧啶脱氨酶融合系统,通过流式细胞初步活性评估,原生质体测试内源基因结合二代测序进一步验证,及农杆菌转化或基因枪瞬时转化法等结合一代测序获得相应的点突变植物;【结果与分析】一,在水稻,小麦及玉米中建立了PBE单碱基编辑体系。利用rAPOBEC1与nCas9融合蛋白(PBE),通过报告系统及原生质体瞬时转化内源基因靶点,结果表明PBE在原生质体中可实现脱氨化窗口为7个核苷酸的有效编辑,单个C的替换效率为0.39-7.07%,多个C的替换效率高达12.48%;在T0代植物中的替换效率高达43.48%。二,在小麦及水稻中建立了高效的A3A-PBE单碱基编辑体系。利用APOBEC3A与nCas9融合蛋白(A3A-PBE),通过报告系统及原生质体瞬时转化10个内源基因靶点,验证A3A-PBE活性并与PBE进行比较,结果表明A3A-PBE在原生质体中可实现平均编辑效率高达13.1%的C-T替换,约为PBE效率的13倍;A3A-PBE对所编辑C的上下文无序列偏好性,可高效编辑5’-GC-3’序列,相比PBE具有明显的优势,效率可高达42.1%;脱氨化的窗口明显拓宽,可覆盖靶序列的17个核苷酸,大幅扩大了其在植物基因组的靶向范围;A3A-PBE在原生质体中可对基因启动子区同时进行多个调控元件的编辑,创制一系列的突变;基因枪瞬时转化小麦和农杆菌转化水稻获得的T0代C-T突变体效率分别高达22.5%和82.9%,纯合突变效率分别高达5.0%和17.1%,且获得了具有除草剂抗性的小麦新型位点突变体。三,在小麦原生质体中实现了A3A-PBE-AUGI RNPs的单碱基编辑,平均C-T替换效率为1.8%;【结论】单碱基编辑技术无需DSB的产生以及无需供体DNA的参与,具有简单,广适且高效的特点。因此,该技术在作物中的成功建立和应用,为高效大规模创制单碱基突变提供一个强有力的方案,对作物遗传改良和新品种的培育具有重要的意义。