有规律间隔的短回文重复序列簇及其相关系统(CRISPR/Cas)是广泛存在于古细菌和真细菌中的一种消除外源DNA 的防御系统。最近,人们优化了这一体系,利用Cas9 蛋白与向导RNA(guide RNA,gRNA)构成一个简单的CRISPR/Cas 系统,在人类细胞、小鼠、斑马鱼、果蝇等多种生物体内成功地实现了基因打靶。其中,Cas9 蛋白作为核酸酶切割双链DNA,而gRNA 则通过碱基互补配对决定靶序列的特异性。然而,这一技术在斑马鱼中基因打靶的效率还有待提高,并且对斑马鱼基因组的脱靶效应也缺乏分析。在本研究中,我们根据斑马鱼的密码子偏好性优化了Cas9 的编码序列(称为zCas9),并与之前报道的人源化的Cas9(humanized Cas9,hCas9)的效率进行了比较。结果显示,在所检测的全部11个位点中,zCas9 的效率均高于hCas9,提高的幅度从4％到39％不等。其中,效率较低的位点差异更为明显,效率至少可提高一倍,甚至将无活性的位点转变为有活性的位点。靶向rpl11(ribosome protein L11)基因的位点是一个高活性位点,zCas9 与相应的gRNA 共注射后,斑马鱼胚胎出现跟注射反义寡核苷酸类似物morpholino(MO)类似的表型,这进一步证明了zCas9 对该位点的高诱变活性。同时,我们选择了另一个效率较高的位点CNT05 分析了zCas9 在斑马鱼中的脱靶效应。为此我们首先编写了一个程序用来预测潜在的脱靶位点,然后通过PCR 扩增结合深度测序分析脱靶情况。结果显示,在全部21 个可检测的潜在脱靶位点中,zCas9 注射组的突变率跟对照相比均没有显著差异。以上结果表明,zCas9 能够在斑马鱼中介导高效、高特异性的基因组定点突变。