【摘 要】
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目的 研究一种高效表达铜绿假单胞菌海藻酸裂解酶(algL)的方法,大量获得重组蛋白后并测定其活力.方法 根据GenBank上发表的algl基因序列设计引物,PCR扩增后得algl基因片段,对目的基因片段进行密码子优化得到algL-O,将其导入克隆载体pUC57,构建重组质粒pUC57-algL-O,再利用双酶切后获得目的基因片段algL-O,通过酶切及连接反应将algL克隆入原核表达载体pET30
【机 构】
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潍坊医学院附属医院检验科 潍坊医学院医学检验学系
【出 处】
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第六届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学论坛
论文部分内容阅读
目的 研究一种高效表达铜绿假单胞菌海藻酸裂解酶(algL)的方法,大量获得重组蛋白后并测定其活力.方法 根据GenBank上发表的algl基因序列设计引物,PCR扩增后得algl基因片段,对目的基因片段进行密码子优化得到algL-O,将其导入克隆载体pUC57,构建重组质粒pUC57-algL-O,再利用双酶切后获得目的基因片段algL-O,通过酶切及连接反应将algL克隆入原核表达载体pET30a(+),构建原核表达质粒pET30a(+)-algL-O.将鉴定正确的阳性重组质粒pET30a(+)-algL-O转化BL21(DE3),IPTG诱导重组质粒的表达,表达产物经SDS-PAGE电泳及Western blot分别测定其大小和特异性,用镍柱亲和层析法纯化融合蛋白,用BSA标准曲线测定纯化蛋白的浓度并进行酶活力的检测.结果 成功克隆algL基因并获得高效表达.SDS-PAGE分析可见39kD的目的蛋白表达条带.Western blot结果显示在相对分子量约为39.2 kD处呈现特异性阳性条带.在550 nm下测定吸光度,计算出酶活力约为460 U/ml.结论 成功高效表达出algL-O蛋白,且其酶的活力表现良好.
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