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目的 糖尿病的发病率逐年增高,已成为危害人类健康的重大疾病.胰岛素抵抗是糖尿病发生的主要原因,也是导致糖尿病及其并发症形成的关键病理生理基础.新近发现的脂肪因子Apelin广泛分布于机体多种组织包括心脏中,研究提示Apelin具有代谢调节和心肌保护作用,但相关机制尚待阐明,本研究将从Apelin这个新视点深入研究其在胰岛素抵抗和心血管保护中的作用,为糖尿病及其心血管并发症的治疗提供新的思路和靶点.方法 ①收集2010-2011年在我院行口服葡萄糖耐量实验(OGTT)患者的空腹和餐后2h血清,根据临床症状和生化检测指标(依据WHO1999年标准)诊断为2型糖尿病,排除患有肿瘤和严重感染的患者.其中2型糖尿病患者131例,健康人血清样品54例.自动生化仪分析仪检测空腹血糖、胰岛素、总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固,ELISA方法分批检测其中Apelin、ROS、TNF-α等水平变化,计算HOMA-IR指数,判断2型糖尿病患者胰岛素抵抗状况.我院病理科收集符合上述标准的糖尿病患者心肌组织.检测标本中的Apelin及糖原含量.②成年雄性ob/ob小鼠,结扎左冠状动脉造心肌梗死模型,结扎前30min腹腔注射20nmol/kg的Apelin,检测各组间Apelin、ROS、TNF-α,心肌细胞凋亡及心肌梗死面积.③用ing/ml TNF-α诱导鼠心肌H9c2细胞系建立胰岛素抵抗心肌细胞模型,C57BL/6小鼠背部皮下埋置TNF-α(8 μ g/kg·day)渗透压缓释泵处理7d,建立TNF-α诱导的胰岛素抵抗动物模型.④用Apelin不同浓度和时间处理胰岛素抵抗细胞模型,通过蒽酮法检测糖原水平,筛选合适的作用条件.以4 nmol/L的Apelin作用于胰岛素抵抗细胞模型4h,胰岛素抵抗小鼠腹腔注射20 nmol/kg Apelin,通过蒽酮法检测心肌组织糖原水平,流式细胞仪DCFH-DA探针和DHE组织染色检查ROS,Western blot检测胰岛素信号通路中相关信号分子JNK、IRS1、AKT、GSK蛋白表达和磷酸化水平,TUNEL法检测梗死周边心肌组织细胞凋亡,TTC Evans blue双染色检测心肌梗死面积.⑤给予胰岛素抵抗H9c2细胞模型4 nmol/L的apelin及Apelin-si-RNA预处理、胰岛素抵抗小鼠模型注射20nmol/kg的F13A预处理30 min后加入Apelin,观察上述指标变化情况.⑥ROS来源主要有NO合酶途径、NOX途径、线粒体呼吸链途径和黄嘌呤氧化酶,应用各个途径的抑制剂研究Apelin抑制ROS生成的主要途径.结果 ①和正常对照组相比,2型糖尿病患者空腹及餐后血糖、胰岛素及糖化血红蛋白均显著增高,HOMA-IR指数评估患者呈现胰岛素抵抗.患者血清Apelin水平也明显高于健康人群,同时伴有炎性因子TNF-α和ROS含量的显著增高.②在糖尿病胰岛素抵抗ob/ob小鼠中检测上述指标.结果和临床研究相一致,ob/ob小鼠血清和心肌组织中Apelin、TNF-α和ROS含量均显著增高.③1ng/L的TNF-α诱导48h可显著增加细胞内糖含量,出现胰岛素抵抗的现象,Apelin在mRNA和蛋白水平表达增加④Apelin处理可使胰岛素抵抗H9c2细胞内糖含量降低.Apelin (20 nmol/kg)可抑制ob/ob和胰岛素抵抗C57/BL6小鼠心肌细胞凋亡,缩小缺血后梗死面积.⑤ROS产生酶体的抑制剂结果显示,TNF-α处理后ROS水平较对照显著增加,仅iNOS抑制剂1400W处理组ROS水平与TNF-α处理组相比显著降低,而其它通路抑制剂处理则几乎不影响ROS生成增加,表明NOS是TNF-α诱导H9c2产生ROS的主要来源,Apelin可以显著抑制TNF-α和缺氧诱导的iNOS蛋白表达.⑥TNF-α促使JNK、IRS1Ser307磷酸化水平升高,AKT、GSK磷酸化水平下降,胰岛素信号通路被抑制,Apelin处理后胰岛素抵抗心肌细胞和小鼠心脏组织JNK磷酸化水平降低,IRS1 Ser307磷酸化水平下降,AKT、GSK磷酸化水平上升,胰岛素信号通路被激活；Apelin受体竞争性拮抗剂APJ和Apelin-si-RNA可以在整体动物和细胞水平抑制上述胰岛素信号通路的激活.结论 本研究表明在胰岛素抵抗状态下,血清和心肌组织中的脂肪因子Apelin含量增加,Apelin通过抑制iNOS蛋白表达,降低ROS的生成,激活JNK-IRS1-AKT-GSK胰岛素信号通路,改善整体和心脏组织的胰岛素敏感性,抑制心肌细胞凋亡,从而对胰岛素抵抗及胰岛素抵抗伴发的心肌损伤易感性增加产生保护作用.总之,脂肪因子Apelin在胰岛素抵抗研究中呈现出的良好应用前景为2型糖尿病及其心血管并发症的治疗提供了新的治疗靶点.