【摘 要】
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Cas9核酸酶对靶向识别区的序列结合和切割是否依赖向导RNA与靶DNA间严格互补配对,这个问题的回答将加深我们对Cas9切割特异性机制的认识。本研究选择EMX1基因作为DNA靶标,并
【机 构】
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南开大学化学学院南开大学元素有机化学国家重点实验室农药国家工程研究中心(天津);
【基金项目】
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科技部(2017YFD0200501);国家自然科学基金(21332004);南开大学“万香会议奖学金”的支持
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Cas9核酸酶对靶向识别区的序列结合和切割是否依赖向导RNA与靶DNA间严格互补配对,这个问题的回答将加深我们对Cas9切割特异性机制的认识。本研究选择EMX1基因作为DNA靶标,并体外诱导表达纯化3种Cas9变异体(N497A-R661A-Q926A,N497A-Q695A-Q926A和N497A-R661A-Q695A-Q926A),并对12种靶DNA突变体进行体外切割研究,比较不同Cas9变异体对靶DNA突变体的容忍性。结果表明,Cas9经DNA非特异结合相关氨基酸位点的改变后,能显著降低对这些突变位点DNA的切割能力,但其核酸酶活性相比野生型也显著下降(近50%-100%),揭示出这些氨基酸位点参与调节切割活性和切割特异性间的平衡。这些数据将为我们继续发掘更具高活性、高保真的Cas9核酸酶具有指导意义。
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