【摘 要】
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目的 研究乙型肝炎病毒(HBV)DNA上的突变所造成HBV RNA上La protein结合位点的缺失对HBV RNA在宿主细胞内稳定性的影响,评价HBV DNA上这个位点对HBV生命周期的重要性,从而寻找新的抗HBV靶点.方法 应用PCR,分子克隆和定点突变技术,针对La protein与HBV RNA结合的相关位点,构建缺失了La protein结合相关位点的HBV突变载体,命名为pHBV-m
【机 构】
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武汉,华中科技大学同济医学院附属同济医院肝病研究所,430030
【出 处】
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第五届全国肝脏疾病临床暨中华肝脏病杂志成立十周年学术会议
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目的 研究乙型肝炎病毒(HBV)DNA上的突变所造成HBV RNA上La protein结合位点的缺失对HBV RNA在宿主细胞内稳定性的影响,评价HBV DNA上这个位点对HBV生命周期的重要性,从而寻找新的抗HBV靶点.
方法 应用PCR,分子克隆和定点突变技术,针对La protein与HBV RNA结合的相关位点,构建缺失了La protein结合相关位点的HBV突变载体,命名为pHBV-mLa;通过计算机预测突变后,这段序列所在的HBV RNA片段的二级结构;应用脂质体将未突变的HBV载体和HBV突变载体分别瞬时转染入HepG2细胞株中;半定量RT-PCR检测HBsAg mRNA和HBeAg mRNA,ELISA检测HBsAg和HBeAg表达情况.
结果 酶切鉴定和碱基测序证明,成功构建了La protein结合相关位点部分碱基缺失的HBV突变载体--pHBV-mLa;突变后的HBV RNA二级结构同突变前的比较,完全改变;转染后半定量RT-PCR检测,发现突变后HBV HBsAg mRNA和HBeAg mRNA水平均明显降低,ELISA检测发现突变引起HBsAg和HBeAg表达下调.
结论 由于HBV DNA上的人工突变,所引起的HBV RNA上La protein结合位点相应的改变,使得HBV RNA特殊的二级结构改变,导致La protein与HBV RNA结合松弛、解离,无法保护HBV RNA(HBsAg mRNA和HBeAg mRNA),RNA酶就可以引起HBV RNA的降解,从而使HBV RNA水平降低,影响HBV各种蛋白的表达.本实验表明,在HBV DNA上,这个位点碱基序列的保守性使HBV RNA可以形成特殊的二级结构,这个结构影响着HBV RNA在宿主细胞内的稳定性,所以HBV DNA上这个位点的存在和保守对HBV生命周期至关重要.
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