论文部分内容阅读
气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)在昆虫寄主定位、产卵地选择等行为中发挥重要作用,克隆与鉴定大豆蚜Aphis glycinesOBPs基因、明确其与配体化合物的结合特性有助于阐明大豆蚜嗅觉识别的分子机制。利用RT-PCR及RACE技术克隆大豆蚜OBP2与OBP7基因。运用分子生物学软件对获得的编码序列全长进行序列分析、同源性比对及构建系统进化树。通过实时定量PCR分析(qRT-PCR)AglyOBP2与AglyOBP7在大豆蚜不同发育阶段和不同组织中的表达模式。构建原核表达载体pET30a-AglyOBPs,进行原核表达及蛋白纯化。利用荧光竞争结合实验对AglyOBP2蛋白与28种配基化合物的结合特性进行分析。成功获得大豆蚜OBP2与OBP7基因AglyOBP2与AglyOBP7(GenBank登录号:KF923843;KF923848)的编码序列全长,其完整开放阅读框大小分别为1145bp、812bp,编码243aa、154aa,具有气味结合蛋白典型的6个保守半胱氨酸结合位点。荧光定量PCR结果表明,2种AglyOBPs在大豆蚜各生长发育阶段均有表达,并且均在4龄期若蚜有一个表达高峰,成蚜期又下降恢复到之前的水平,这种现象暗示了2种AglyOBPs基因在大豆蚜从若蚜进入成蚜这个阶段可能发挥了特定的作用。AglyOBP7在有翅和无翅成蚜发育阶段的表达量相当,而AglyOBP2在有翅中的表达量显著高于无翅成蚜,这种表达差异反映出AglyOBP2在大豆蚜有翅成蚜搜寻寄主过程中发挥重要作用。AglyOBP2和AglyOBP7在触角组织的表达量显著高于其它组织,推测这2种气味结合蛋白参与大豆蚜触角的嗅觉识别过程。经预测AglyOBP2与AglyOBP7成熟蛋白分别大小为26.10kDa与17.59kDa。SDS-PAGE结果显示融合蛋白成功表达。荧光竞争结合实验对告警信息素和27种植物挥发物结合发现,AglyOBP2和AglyOBP7对C6~C8的小分子气味物质有广谱的结合特性,但结合能力存在差别。其中,AglyOBP2对东农46大豆挥发物组份的结合能力要显著强与AglyOBP7,AglyOBP2对2-甲基-4-戊烯醛、2-正丁基辛醇和顺-3-己烯醇的结合能力最强,解离常数分别为9.1、9.7和9.8μmol/L。AglyOBP7与报警信息素反-β-法呢烯的结合能力最强,解离常熟为1.9μmol/L,而AglyOBP2不结合,表明AglyOBP7很可能是识别大豆蚜告警信息素的重要功能蛋白。