半胱氨酸蛋白酶抑制剂作为一类专门抑制活性中心含有半胱氨酸(cySH)残基的蛋白酶抑制剂在各种生物中广泛存在。相较于cystatin C被广泛研究,cystatin F在抑制半胱氨酸蛋白酶的过程中的作用机制目前未见报道。本实验,首先构建了重组质粒pPIC9K-CST7并将其转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115菌株中,通过外源基因表达及一系列纯化步骤,最终得到具有活性的cystatin F重组蛋白。同时对cystatin F进行半胱氨酸蛋白酶抑制活力的测定,其IC50值为4.78μM。通过荧光光谱及圆二色谱分析,对蛋白酶抑制剂cystatin F与半胱氨酸蛋白酶相结合时分子结构的变化进行了初步表征。进一步地,利用等温滴定量热技术对蛋白酶抑制剂cystatin F与半胱氨酸蛋白酶相结合时的热力学常数以及抑制酶反应过程的动力学常数进行测定,其结合常数Ka值为2.242×10~6,化学计量比n=1,在不同cystatin F浓度条件下,酶反应Vmax无明显变化,而Km值在不断减小,符合竞争性机制模型。本研究为日后半胱氨酸蛋白酶抑制剂的制备,以及半胱氨酸蛋白酶抑制剂的研究与应用提供了理论基础。