柑橘中存在很多红肉突变体,其果肉中因积累高含量的番茄红素而呈现鲜艳的红色。红暗柳就是暗柳甜橙的一个红肉突变体,其果肉中番茄红素含量提高了上千倍。番茄红素β环化酶(LCYBs)是控制番茄红素环化的关键基因,据报道有色体特异性的LCYBs基因(CYCb)是造成果实和花中番茄红素异常积累的关键基因。因此,本研究中主要以LCYBs基因为切入点,探讨其在柑橘果实红肉突变性状形成中的作用,为寻找柑橘红肉突变的分子机理提供新的线索。选取暗柳甜橙、红暗柳甜橙,以及一些有代表性的不同番茄红素积累的其他柑橘品种,进行DNA、RNA提取,cDNA合成;基因全长及其启动子序列克隆;原核表达、工程菌试验及HPLC分析基因功能;qRT-PCR检测基因表达;生物信息学分析;番茄瞬时表达检测启动子活性。首先克隆了2个LCYBs基因(CsLCYb、CsCYCb)全长,发现这2个基因分别含有2个不同的等位基因(CsLCYb1、CsLCYb2、CsCYCb1、CsCYCb2);检测发现CsLCYb1、CsLCYb2、CsCYCb1都能将红色番茄红素环化产生黄色的β-胡萝卜素,相比而言CsCYCb2活性较弱;普通qRT-PCR检测暗柳和红暗柳不同组织中基因表达,发现CsLCYb主要在叶片中表达,而CsCYCb主要在花和果实中表达,并且在果实不同发育时期中CsCYCb在红暗柳中的表达都比暗柳低;在根和茎中都能检测到2个基因表达,CsCYCb比CsLCYb稍高。进一步采用特异性较高的Taqman探针分析不同等位基因表达,发现CsLCYb 2个等位基因在暗柳和红暗柳中表达一致,均以CsLCYb1表达为主;而CsCYCb 2个等位基因表达在暗柳中没有显著差异,但是CsCYCb2在红暗柳中表达较高。由此推测,CsCYCb基因低水平表达以及CsCYCb2在红暗柳红肉突变性状形成中起着非常重要的作用。此外,还从不同柑橘品种中分别克隆了CYCb基因,分析CYCb等位基因结构多态性及进化特点,发现甜橙中CsCYCb1来源于柚,而CsCYCb2来源于橘,通过点突变方法发现359位氨基酸是影响酶活性的关键位点。进一步采用qRT-PCR证实有色体特异性的CYCb基因在果肉类胡萝卜素代谢中起关键作用,以及CYCb基因表达与番茄红素含量之间呈现负相关关系。为了分析红暗柳中CsCYCb等位基因差异表达的分子机理,克隆了CsCYCb不同等位基因上游的启动子序列,利用在线网站PLACE和PLANTCARE初步分析了启动子顺式和反式元件;同时将启动子全长连接GUS报告基因构建表达载体,采用农杆菌注射番茄果实瞬时表达,根据GUS染色程度发现CsCYCb2启动子活性较弱;为下一步分析启动子顺式元件和筛选相关的转录因子提供了线索。