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引言牛流行热是由牛流行热病毒(Bovine Ephemeral Fever Virus,BEFV,又名牛暂时热病毒)引起的一种急性热性传染病。引起牛大群发病,病势迅猛,感染公牛精子畸形率达70%以上;感染奶牛产乳量明显下降,乳品质量降低,造成严重的经济损失。防治该病当前主要依靠弱毒疫苗,致弱过程可能出现了免疫原性丢失,因而免疫性较差,保护率不足,研制新型BEFV疫苗以及诊断试剂对防控该病具有重要意义。材料与方法对Genebank数据库中的BEFV糖蛋白G基因序列进行比对分析,以中国发布的LS11、LYC11、JT02L、JB76H等为主要参考序列,形成最具代表性的BEFV G基因序列,再通过杆状病毒载体最适密码子优化,最终确定BEFV-G基因序列及其末端加入His标签,然后人工合成该序列。对合成序列所在质粒载体和Bac-to-Bac转座载体pFastBacTM1经BamH I、HindⅢ酶切、回收、连接等制备重组转座质粒。将阳性重组转座质粒分别转化到含有穿梭载体Bacmid和辅助质粒的感受态细胞DH10BacTME.coli中,经三抗培基、琼脂糖凝胶电泳、PCR、酶切等方法鉴定筛选,大量制备正确的重组穿梭质粒;将含有BEFV-G基因的重组穿梭质粒转染昆虫细胞Sf9,根据空斑试验结果收集病毒液,SDS-PAGE、Westernblot对细胞表达产物进行检测和分析。结果和讨论重组转座质粒经再次测序证明正确,命名为pFast-BEFV-G;三抗培基筛选出的重组穿梭质粒(重组Bacmid质粒),经鉴定正确,命名为rBacmid-BEFV-G;rBacmid-BEFV-G转染Sf9后昆虫细胞,收获和扩增含BEFV-G基因的重组病毒。培养液SDS-PAGE、Westernblot均检测到BEFV-G基因的表达产物。成功构建了含人工优化合成的BEFV-G基因的重组杆状病毒,并在Sf9细胞表达了该蛋白,为研制新型牛流行热疫苗以及诊断试剂提供实验基础。