【摘 要】
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病毒诱导的基因沉默(Virus Induced Gene Silencing,VIGS)是重组病毒载体沉默内源基因表达的技术,在植物抗病性、逆境胁迫、细胞信号传导以及次生代谢生物合成途径基因功能研究中发挥重要作用.番茄抗青枯病的机制研究是当今世界上植物抗病研究的热点和难点之一.乙酰化是最早被发现的与转录有关的组蛋白修饰方式,研究表明组蛋白乙酰化和去乙酰化主要参与植物的生长发育和应对外界环境变化.项
【机 构】
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广东省农业科学院蔬菜研究所,广东省蔬菜新技术研究重点实验室,广州510640
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病毒诱导的基因沉默(Virus Induced Gene Silencing,VIGS)是重组病毒载体沉默内源基因表达的技术,在植物抗病性、逆境胁迫、细胞信号传导以及次生代谢生物合成途径基因功能研究中发挥重要作用.番茄抗青枯病的机制研究是当今世界上植物抗病研究的热点和难点之一.乙酰化是最早被发现的与转录有关的组蛋白修饰方式,研究表明组蛋白乙酰化和去乙酰化主要参与植物的生长发育和应对外界环境变化.项目组前期利用生物信息学、基因表达分析、Western-blot、ChIP技术系统分析了组蛋白乙酰化参与抗、感青枯病品种的抗病反应通路及抗病机制.本研究中主要通过利用VIGS技术,分别沉默番茄组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases,HDACs)基因家族15个基因中的 12个(SlHDA1、SlHDA3、SlHDA4、SlHDA6、SlHDA7、SlHDA8、SlHDA9、SlHDT1、SlHDT2、SlHDT3、SlSRT1和SlSRT2)基因,并对沉默植株接种青枯菌开展抗病鉴定,旨在为番茄抗青枯病基因功能研究提供理论基础.用Trizol(Invitrogen)法提取Heinz 1706番茄叶片总RNA,经DNaseI处理去除基因组DNA,经M-MLV反转录合成第一链cDNA做模板,根据番茄基因组数据库(SGN,http：//solgenomics.net,release v2.4)SlHDACs基因序列,利用Oligo6.0设计引物,上、下游引物分别加上EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ酶切位点,扩增连接T载体测序验证后,将正确的目的基因片段与沉默载体TRV2连接转化,经PCR和双酶切验证,成功获得12个SlHDACs基因的TRV2-SlHDACs载体,通过热激法转入农杆菌GV3101用于侵染.以生长10 d左右的高抗青枯病LS89 和感青枯病Heinz1706 为试材,通过注射压迫法把带有TRV1和TRV2-SlPDS、TRV2-SlHDACs的重组病毒载体的农杆菌GV3101注射到番茄子叶中,并选取注射不含目的基因的载体为对照.接种两周后,TRV2-SlPDS植株新生叶片开始呈现光漂白现象,待沉默表型稳定后,利用Q-PCR开展接种材料的表达分析,结果表明SlPDS基因和SlHDACs基因表达均下调；选取基因表达下调一致的幼苗为试材,接种青枯病菌,并统计0～30 d的发病率；结果发现在感病品种中与对照(发病率100％)相比,SlSRT2、SlHDA6基因沉默后感病品种的发病率降低,分别为54.17％和50.00％；在抗病品种中与对照(发病率12.50％)相比,SlHDT1、SlHDA1、SlHDA9基因沉默后提高了抗病品种的发病率,分别为78.57％、52.27％和54.16％.
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