【摘 要】
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目的 本研究利用TM4细胞(小鼠睾丸支持细胞株)探索铅在睾丸细胞中的蓄积与排出,以及铅的排出是否与MRP1(多重耐药蛋白1)和GSH有关.方法 在TM4细胞培养基中分别加入不同浓度的醋酸铅、MK571、BSO、EA处理24 h,CCK-8检测各实验组TM4细胞的活力；经典酶法检测各组细胞内还原型GSH含量和GSTs活力；酶标仪测定细胞内荧光阴离子蓄积量的方式确定TM4细胞MRP1的转运活性(荧光底
【机 构】
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武汉大学公共卫生学院,武汉湖北430072
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目的 本研究利用TM4细胞(小鼠睾丸支持细胞株)探索铅在睾丸细胞中的蓄积与排出,以及铅的排出是否与MRP1(多重耐药蛋白1)和GSH有关.方法 在TM4细胞培养基中分别加入不同浓度的醋酸铅、MK571、BSO、EA处理24 h,CCK-8检测各实验组TM4细胞的活力；经典酶法检测各组细胞内还原型GSH含量和GSTs活力；酶标仪测定细胞内荧光阴离子蓄积量的方式确定TM4细胞MRP1的转运活性(荧光底物为calcein-AM)；以0～100 μmol·L-1的醋酸铅分别处理12和24 h后检测细胞内铅蓄积量；为了解TM4细胞排铅情况,用醋酸铅20 μmol·L-1培养TM4细胞24 h后,换为分别加有能量代谢抑制剂叠氮化钠,GSH生物合成抑制剂BSO和MRP1转运活性抑制剂MK571的无铅培养基继续培养,再分别收集1,3,6,9和12h各时点细胞,石墨炉原子吸收法检测细胞内铅含量运,以BCA法测各自总蛋白含量进行标化.用qRT-PCR法检测细胞中MRP1基因mRNA表达.结果 (1)随着醋酸铅处理浓度增加,TM4细胞活性呈先增高后降低的趋势,且当醋酸铅处理浓度达到100 μmol·L-1,细胞活性降低至对照组的54％(P＜0.05)；抑制剂MK571,EA和BSO的剂量低于50 μmol·L-1时,TM4细胞的活性与对照组比差异无显著性(P＞0.05).(2)随加入醋酸铅的浓度的增加,还原型GSH的含量呈先增高后降低的趋势,细胞内GST活性则呈持续上升的趋势；同时加入醋酸铅和BSO组的GSH含量显著低于单加醋酸铅组(P＜0.05).(3)TM4细胞转运活性随MK571浓度的增加而降低,随醋酸铅浓度的增高而增加.(4)随加入醋酸铅浓度的增加,细胞内铅含量明显增加(P＜0.05),且相同醋酸铅浓度处理下,12h时点细胞中的铅含量显著高于24 h(P＜0.05).(5)铅处理TM4细胞24 h后换为分别加有抑制剂叠氮钠、MK571和BSO的培养基继续培养1 ～12h不等,检测显示换无铅培养基3,6,9和12h各时点细胞内铅残留量显著高于对照组(P＜0.05),即抑制剂延缓细胞内铅的排出.(6) qRT-PCR结果显示,加入0,5,10,20 μmol·L-1的醋酸铅处理TM4细胞6和12h,MRP1基因表达变化差异无显著性(P＞0.05)；当醋酸铅处理时间达24 h,MRP1mRNA表达随醋酸铅浓度的增高而显著上调(P＜0.05).结论 铅能够在TM4细胞中蓄积,细胞内铅的排出依赖于还原型GSH以及消耗ATP的外排泵-多重耐药蛋白MRP1.
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