引言性别分化一直以来都是遗传学、发育生物学和畜牧学等多领域的研究热点,尤其是动物的性别与某些经济性状有着直接或间接的关系,了解和掌握性别分化机制具有重要的经济意义.目前鸟类关于性别分化方面的研究鲜有报道,禽类的性别分化机制仍不清楚.与此同时,单性化养殖在提高家禽的生产效率和养殖产量方面具有重要的应用前景,其成功开展需要成熟的性别控制技术作为基础,但是对家禽的性别分化机制的了解仍然处于初步阶段,因此开发有效的性别控制技术实现大规模养殖仍然存在很大难度.材料与方法以中国农业科学院家禽研究所提供的如皋黄鸡受精蛋为材料,分别在0、4.5 和18.5 胚龄收集胚胎干细胞、原始生殖细胞和精原干细胞.性别鉴定后提取细胞总RNA 进行转录组测序.对差异表达基因分析和通路富集,筛选潜在的性别决定和分化基因.通过性别反转模型检测筛选的性别决定和分化基因的表达变化.结果通过流式细胞分选和性别鉴定技术获取两性生殖细胞后提取总RNA 进行测序,测序结果显示,两性ESCs 之间无差异表达基因,其他各组均有差异表达基因,两性PGCs 之间存在差异表达基因,共有227 个差异表达基因,这说明在ESC 阶段两性细胞之间并没有显著差异,而在PGCs 阶段,两性细胞已经开始出现差异表达.发现在雄性ES 到PGC 过程中,存在7697 个差异表达基因；在雌性ES 到PGC 过程中,存在4648个差异基因.与SSC 相比,雄性PGC 有6226 个差异基因,雄性ESC 有7868 个差异基因；雌性PGC 有7184个差异基因,雌性ESC 有6466 个差异基因,说明在发育过程中,两性生殖细胞存在表达上的差异. 通过对这些差异基因通过联合分析,我们发现在早期生殖细胞性别发育过程中,WT1 和AR在雄性ES 发育至PGC过程中存在显著表达；FGF9 和WNT4 在雌性ES 向PGC 发育过程中显著表达；SOX3,SOX9 和FOXL2 在两性ES 向PGC 发育过程中均存在显著表达.与已经发育成雄性的SSC 比较,我们发现FOXL2,AR,SOX3,FGF9,WNT4,WT1 和SOX9 在两性早期生殖细胞发育过程中均存在差异表达,这也就暗示了这几个基因可能在两性生殖细胞发育过程中可能扮演重要的作用,可以作为潜在的性别决定基因进行进一步的研究.我们进一步检测了FOXL2,AR,SOX3,FGF9,WNT4,WT1 和SOX9 在正常两性生殖细胞中的表达,发现在4.5 天时,各个基因在两性之间的表达量和测序结果一致,说明了测序结果的准确性.同时进一步检测在性别反转过程中的表达,发现FGF9 和WNT4 在反转过程中存在较大的表达变化,暗示其在性别维持和决定分化中起到了十分重要的作用.讨论与结论本研究对不同性别间生殖细胞的差异表达基因进行分析和通路富集,筛选候选性别分化和决定基因FOXL2,AR,SOX3,FGF9,WNT4,WT1 和SOX9,并检测其在性别反转过程中的表达,发现FGF9 和WNT4在性别反转过程中存在较大的表达变化,表明其在性别维持和决定分化中起到了十分重要的作用.此外,本实验还发现了许多尚未获得确切功能验证的基因,这些基因可能成为新的性别决定候选基因,其具体功能有待进一步验证.高通量测序是目前揭示胚胎发育分子机制的重要手段.本研究的重点是不同性别间生殖细胞的基因表达差异和信号通路差异,这在以往的研究中很少被提及.因此,本研究在实验材料的选取和实验数据的分析上,为开展鸡(禽类)胚胎发育分化和性别决定奠定了新的基础.