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引言猪瘟(Classical Swine Fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起猪的一种急性、热性和高度接触传染的病毒性传染病,对养猪业危害十分严重,被国际兽疫局(OIE)列为16种A类法定传染病之一,也是我国法定的一类动物疫病。猪瘟弱毒疫苗在中国的大规模应用,使猪瘟野毒感染和疫苗接种的区分变得困难且十分必要。为建立一种能够应用于临床样本猪瘟病毒(CSFV)检测的快速、简便且标准化程度高的检测技术,以满足畜牧业生产和成功开展猪场净化的需求,本研究建立的mRT-PCR方法具有敏感性、特异性强、重复性好的特点,对养猪业的发展与猪厂净化具有十分重要的意义。材料与方法本研究根据GenBank中22个猪瘟野毒与疫苗毒及近源病毒的基因组序列对比分析,发现猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株3′NTR独立存在富含T的插入序列,根据这一特点选择特异保守区域应用DNAStar、Oligo、MPprimer and MFE primer设计多重PCR引物,并挑选最佳的2对猪瘟病毒引物,优化筛选能够鉴别猪瘟野毒与兔化弱毒疫苗的PCR退火温度,经多重试验组合建立了一套鉴别猪瘟野毒和疫苗毒的2重RT-PCR鉴别诊断方法。结果与讨论扩增反应条件的确定试验表明,退火温度为58℃特异性分析表明,从弱毒C株和石门强毒株的基因组中分别扩增出1条大小为278和641 bp的特异性片段,从强弱毒株混合物中1次扩增出2条大小为278和641 bp的特异性片段;特异性分析表明,检测不到PRV、PRRSV、SIV、PCV2的DNA/RNA;敏感性分析表明,该方法能检测出0.82pg的猪瘟病毒RNA;应用试验表明,9份疑似猪瘟病料中3份为强毒感染,1份为弱毒感染,1份为弱毒和强毒的混合感染。多重PCR反应中,引物设计至关重要,它是决定多重PCR成败的关键,充分考虑PRV G+C含量较高而PPV G+C含量较低的问题,Tm值应该控制在55℃~63℃,确保在某一温度都能进行很好的PCR反应,尽量避免引物间非特异性扩增。敏感性试验结果表明,该多重PCR具有很强的敏感性,检测含量达到了pg级。