【摘 要】
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目的：研究DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨(DAC)联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸钠(VAP)对白血病细胞株增殖和凋亡的影响,并探讨药物作用机理.方法：1.细胞培养：常规培养人白血病细胞株U973,取对数生长期的细胞进行实验.2.MTT法检测DAC、VPA单药及两药联合对U937细胞的增殖抑制：DAC的浓度分别为0.1、0.8、1.6mmol/L；VPA的浓度分别为1.0、3.0、5.0mmol/
【机 构】
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河北医科大学第二医院血液科 河北省血液病研究所 河北省血液病重点实验室 河北省石家庄市050000
【出 处】
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河北省免疫学会血液免疫专业委员会第三届年会暨河北省医学会血液学分会青年学组第二次学术会议
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目的：研究DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨(DAC)联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸钠(VAP)对白血病细胞株增殖和凋亡的影响,并探讨药物作用机理.方法：1.细胞培养：常规培养人白血病细胞株U973,取对数生长期的细胞进行实验.2.MTT法检测DAC、VPA单药及两药联合对U937细胞的增殖抑制：DAC的浓度分别为0.1、0.8、1.6mmol/L；VPA的浓度分别为1.0、3.0、5.0mmol/L；DAC (0.8mmol/1)联合VPA(1.0、3.0、5.0mmol/L)分别作用于U937细胞24、48、72小时,MTT检测细胞增殖抑制率.3.AnnexinV/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡：终浓度为0.1、0.8、1.6mmol/L的DAC,终浓度为1.0、3.0、5.0mmol/L的VPA及DAC (0.8mmol/1)联合VPA(1.0、3.0、5.0mmol/L)分别作用于U937细胞72小时,PI染色,流式细胞仪检测细胞凋亡.4.PI染色流式细胞术检测细胞周期变化：DAC浓度分别为0.1、0.8、1.6mmol/L作用于U937细胞72小时,PI染色、流式细胞仪检测细胞周期变化.5.RP-PCR检测DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子P15mRNA表达水平的变化：检测药物处理前后细胞目的基因mRNA表达的变化.6.SPSS 16.0软件分析,分组资料以均数±标准差表示,两组比较应用T检验方法,多组比较应用单因素方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义.结果：DAC、VPA及两药联合对U937细胞增殖的影响：1.随着药物浓度的增加和作用时间的延长,DAC对U937细胞的增殖抑制率由10.1％增加到67.0％,各组进行统计学分析P＜0.05,差异具有统计学意义；VPA的细胞增殖抑制率由17.6％增加到61.8％,各组进行比较显示,VPA在5.0mmol/L时,48小时的增殖抑制率与24小时及72小时的增殖抑制率之间的差别无统计学意义(P＞0.05),VPA浓度在1.0、3.0mmol/L时各组间抑制率有明显差异(P＜0.05)；联合用药组细胞的最大增殖抑制率为89.2％,联合用药组之间比较差异具有统计学意义(P＜0.05).U937细胞的增殖抑制率均随着药物浓度增加和药物作用时间延长逐渐增加.通过国内金氏公式计算,24h、48h、72h的Q值0.983、1.042、0.943；1.079、1.277、1.208； 1.189、1.254、1.137.提示两药联合有协同相加作用.2.DAC、VPA及两药联合对U937细胞凋亡的影响：DAC作用72小时U937细胞的凋亡率由13.17％增加到30.53％,增加而增加,明显高于对照组(P＜0.05)；VPA作用后细胞的凋亡率由28.61％增加到47.30％,细胞凋亡率呈剂量依赖性,各组比较(P＜0.05)；DAC联合VPA作用于U937细胞的凋亡率明显高于单药组,细胞凋亡率最高可达68.40％,各组比较(P＜0.05),结果显示两药联合具有协同促凋亡作用.3.DAC作用72小时U937细胞周期变化：DAC主要作用于S期细胞,随着DAC药物浓度的增加,U937细胞G0/G1期比例逐渐增加,由50.85％增至68.9％,S期比例逐渐减少,由47.78％减至28.11％.各组进行统计学分析P值均＜0.05,差异具有统计学意义.4.RT-PCR检测DNMT1、DNMT3A、DNMT3B及P15 mRNA表达水平的变化：未使用药物处理前DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT 3BmRNA在U937细胞中均有表达,而P 15mRNA在U937细胞中没有表达,DAC作用72小时DNMT1和DNMT3AmRNA表达量减少并随药物浓度的增加表达量逐渐减少,DNMT1mRNA的表达量由6.012减至0.521,DNMT3AmRNA的表达量由5.039减至0.628(P＜0.05),P15mRNA经DAC作用后出现表达并随药物浓度增加而增加,DAC使P15mRNA的表达量由无增至2.078,且VPA能够增强DAC激活P15mRNA表达的作用,两药联合应用使P15mRNA的表达量增至3.911(P＜0.05).DNMT3BmRNA在DAC作用72小时后表达量均没有变化(P＞0.05).结论：1.DAC、VPA对U937细胞均有显著的细胞增殖抑制和凋亡促进作用,并且两药具有协同作用；2.DAC减少S期U937细胞,增加G0/G1期细胞；3.DAC的作用机制可能与抑制DNMT1mRNA和DNMT3AmRNA的表达和激活P15mRNA的表达有关,且VPA能够增强DAC促进P15mRNA的表达.
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