【摘 要】
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[目录]重组抗体具有均一性高,可塑性强,还能够实现抗体的体外进化,是免疫检测技术领域未来重要的发展方向之一.本研究的目的是以分泌沙拉沙星特异性单克隆抗体的杂交瘤细
【机 构】
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中国农业大学动物医学院,北京100193
【出 处】
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2013年中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十二次学术讨论会
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[目录]重组抗体具有均一性高,可塑性强,还能够实现抗体的体外进化,是免疫检测技术领域未来重要的发展方向之一.本研究的目的是以分泌沙拉沙星特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞为起点,通过基因工程技术构建沙拉沙星单链抗体原核表达载体,并对表达的单链抗体进行纯化以及初步鉴定,为以后研究抗原抗体结合机制,奠定基础,从而更好的服务于兽药残留检测分析.[方法]以分泌沙拉沙星特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞为起点,提取RNA,通过RT-PCR反转录成cDNA,根据抗体分型结果,选择合适的引物分别扩增重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),通过重叠延伸PCR,将VH和VL进行连接,并克隆到表达载体pJB33,转化到大肠杆菌RV308中进行目的蛋白的诱导表达并优化诱导条件.通过SDS-PAGE和Western-blot检测目的蛋白并对目的蛋白进行纯化.[结果]经SDS-PAGE和Western-blot分析可知,目的蛋白大小约为32.5KD左右,与预期相符.通过竞争ELISA检测,其能够与沙拉沙星结合,说明构建的单链抗体活性良好.确定最佳诱导条件为0.25mM,16％,200rpm,16h.超声后用Ni柱纯化,经SDS-PAGE和Western-blot分析,结果表明能得到单一目的条带.用超微量紫外可见分光光度计粗略测量目的蛋白浓度,最高可达1.61 mg/ml.[结论]成功构建了原核表达沙拉沙星单链抗体的载体pJB33-sar,并用含有His标签的Ni柱纯化出目的蛋白,所得到的单链抗体活性良好.
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