棉花黄萎病是一种毁灭性病害,严重影响棉花产量和纤维品质.应用抗病品种是防治黄萎病最经济、有效的措施.目前,人们对棉花抗黄萎病机理的了解还不十分清楚,且现有栽培陆地棉中缺乏高抗抗源,因此棉花抗黄萎病育种进展较慢.棉花基因组庞大而复杂,深入挖掘棉花抗病基因、研究抗黄萎病机理对于棉花抗病遗传育种具有重要意义. 全长cDNA是功能基因组学和比较基因组学研究的基础,也是基因克隆的重要方法之一,尤其适用于复杂基因组的非模式植物,它是目前发现新基因的重要工具.近年来,cDNA文库构建技术已在香蕉、大豆、菜豆等中被广泛用做分离鉴定新的功能基因.因此,要克隆棉花中一些重要基因,最好的途径是构建代表特定时期全部细胞表达信息的cDNA文库,并从中筛选相关基因. 本研究利用高抗黄萎病的海岛棉Pima90-53为材料,采用无杂菌、全程可视化定量法接菌,构建了黄萎病菌诱导下的根部全长cDNA文库,并对其进行了质量鉴定和EST序列分析.结果表明,文库的重组率为92.3％,库容量为1.1×106 pfu·mL-1,平均插入片段约1.8 kb,是一个高质量的cDNA文库.随机抽取50000个克隆测序,获得46192个高质量的EST序列.所有EST拼接出28329个Unigenes,其中包括1981 Contigs和26341 Singletons,表明文库冗余度较低,囊括了大量低丰度表达的基因. 生物信息学分析表明,28329个Unigenes可以覆盖289个KEGG代谢路径,其中筛选到3027个与已知抗病功能基因同源的Unigenes,这些基因可以进一步划分为参与初级免疫系统(PTI)、效应分子诱导的免疫系统(ETI)、Ca离子通路、氧化迸发、PR蛋白、细胞壁合成与修饰、植物激素调节及转录因子调节.本文库共筛选到58类棉花转录因子,其中表达丰度较高的类别为NAC、G2-1ike、MYB、BHLH、bZIP、ERF、C3H和WRKY家族. 对文库筛选获得的部分基因进行Real-Time RT PCR分析,结果显示海岛棉Pima90-53中PR10、Bet V1、Chitinases、MLP-like、BAK和MPK4基因可以被黄萎病菌显著诱导,其表达量较对照相比显著增高.此外,部分基因的表达模式在抗病品种Pima90-53和感病品种中棉所8号中存在显著差异,这些基因表现出在中棉所8号中较在Pima90-53中表达量低或者表达高峰出现偏迟.所有上述类别基因可能是构成棉花抗黄萎病的重要遗传基础.