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摘要：目的 观察补肾活血针刺法对阿尔茨海默病（AD）模型SAMP8小鼠行为学及海马内源性神经干细胞增殖的影响。方法 将18只7月龄雄性SAMP8小鼠作为AD模型，随机分为针刺组、非穴组和模型组，另取同月龄雄性SAMR1小鼠6只作为正常组。针刺组小鼠选取“肾俞”“百会”“血海”“膈俞”进行针刺干预，非穴组小鼠取双侧肋下固定非穴点进行针刺，模型组和正常组小鼠予相同程度捉抓刺激，连续干预8周。采用水迷宫实验检测小鼠学习记忆能力，免疫组化检测海马BrdU阳性细胞数。结果 与正常组比较，模型组小鼠逃避潜伏期明显延长（P<0.05），停留在原平台象限时间明显缩短（P<0.05），BrdU阳性细胞数明显减少（P<0.05）；与模型组、非穴组比较，针刺组小鼠逃避潜伏期明显缩短（P<0.05），停留在原平台象限时间明显延长（P<0.05），BrdU阳性细胞数明显增加（P<0.05）。结论 补肾活血针刺法可能通过诱导海马内源性神经干细胞的增殖，改善AD模型SAMP8小鼠的学习记忆能力。
关键词：补肾活血；针刺；阿尔茨海默病；神经干细胞增殖；SAMP8小鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.009
中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）09-0035-04
Abstract： Objective To investigate the effects of Bushen Huoxue acupuncture method on the behavioral changes and the proliferation of endogenous neural stem cells （NSCs） in hippocampus of Alzheimer disease （AD） model mice. Methods 18 male SAMP8 mice， seven months old， were randomly divided into acupuncture group， non-acupoint control group， and model control group. And another age-matched 6 male SAMR1 mice were prepared as normal control group. Mice in acupuncture group were intervened by acupuncture method in the acupoints of “Shenshu”， “Baihui”， “Xuehai”， and “Geshu”. Mice in non-acupoint control group were treated by stimulating the fixed non-point under the bilateral rib， while mice in model control group and normal control group were raised without special treatment but administered the stimulation of catching with the same time and the same stimulus intensity. All treatrment lasted for 8 weeks. After the intervention， the learning and memory abilitities and brain hippocampus BrdU positive cells of all groups were detected. Results Compared with the nomal control group， mice in the model control group had longer escape latency and less time spent in former platform quadrant （P<0.05）； the number of BrdU positive cells decreased significantly （P<0.05）. Compared with the model control group and the non-acupoint control group， mice in the acupuncture group had shorter escape latency and more time spent in former platform quadrant （P<0.05）； the number of BrdU positive cells increased significantly （P<0.05）. Conclusion Bushen Huoxue acupuncture method can improve the learning and memory abilities of SAMP8 mice AD model by inducing the proliferation of hippocampal endogenous NSCs.
Keywords： Bushen Huoxue； acupuncture method； Alzheimer disease； NSCs proliferation； SAMP8 mice
阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种与年龄相关的复杂性神经性疾病，以认知功能进行性减退为特征[1]。本课题组前期研究发现，补肾活血法对AD认知障碍和病情发展有一定的控制作用[2]；补肾活血针刺法通过抗氧化应激、调节β淀粉样蛋白代谢、抑制神经反应及修复细胞骨架等方面的作用改善AD模型小鼠的学习记忆能力[3-4]。神经干细胞（neural stem cell，NSCs）是一类具有自我产生新细胞及分化能力的多能干细胞，其相关研究已成為神经学科领域热点。本实验在前期研究基础上，采用Morris水迷宫实验和免疫组化方法，观察补肾活血针刺法对AD模型SAMP8小鼠行为学及海马内源性NSCs增殖的影响。 1 材料与方法
1.1 动物及分组
清洁级雄性7月龄SAMP8小鼠18只、SAMR1小鼠6只，体质量（28±1.5）g，购于天津中医药大学第一附属医院动物实验中心，动物质量合格证号0001353。饲养于中南大学湘雅三医院实验动物中心，温度20～23 ℃，相对湿度55%～58%，每日12 h照明，自由摄食饮水，单笼通气通风。所有小鼠适应性饲养7 d，AD模型SAMP8小鼠随机分为针刺组、非穴组和模型组，每组6只，6只SAMR1小鼠为正常组。
1.2 主要试剂与仪器
BrdU粉末，美国Sigma；Rat-anti-BrdU，美国Serotec；Goat-anti-rat IgG，德国Vector Laboratories；ABC试剂，德国Vector Laboratories。移液枪，美国Eppendoff；0.30 mm×25 mm华佗牌一次性针灸针，苏州医疗用品厂有限公司；Morris水迷宫，中南大学湘雅三医院动物实验中心；光学显微镜及彩色图像分析系统，日本Olympus。
1.3 干预
针刺组用补肾活血针刺法进行干预，选取“百会”（顶骨正中，即头顶两耳根连线的中点）、“血海”（后肢股内侧中间，髌底内侧端至耻骨联合连线下1/9处）、“肾俞”（第2腰椎下两旁）及“膈俞”（第7胸椎下两旁肋间）。“百会”向前平刺3～4 mm，施捻转平补平泻法；“肾俞”直刺2～3 mm，施捻转补法；“血海”直刺2～3 mm，施捻转泻法；“膈俞”以80°角斜向上刺2～3 mm，施捻转泻法。每个施针穴位间歇5 min，捻转1次。其中“肾俞”“膈俞”“血海”先针刺左侧，隔日再针刺右侧。小鼠穴位定位及针刺深度均参照“动物针灸穴位图谱”[5]。补泻手法参照石学敏院士制定的针刺手法量学标准，即针刺后开始捻转时拇指向顺时针捻转为补，逆时针则为泻[6]。非穴组参照韩景献教授经验采取针刺双侧胁下固定非穴位点作为对照刺激点，斜刺进针2～3 mm，用平补平泻捻转手法进行干预，先针刺左侧，隔日再针刺右侧[7]。模型组和正常组每日参照针刺组以同样方式和程度、在相同时间进行抓取和固定。各组小鼠每日处理1次，连续6 d，第7日休息，连续8周。
1.4 行为学检测
干预结束后采用Morris水迷宫实验进行行为学测试。隐蔽平台实验：将平台放置于第2象限，将小鼠置于平台15 s，并依次从第1、3、4象限入水点投放小鼠，记录该鼠找到平台的时间，即为逃避潜伏期。如小鼠超过60 s尚未找到平台，则由实验者将小鼠引至平台，并让小鼠在平台上停留15 s，逃避潜伏期记为60 s。空间探索实验：撤去平台，由第4象限入水，观察小鼠60 s内无平台条件下寻找记忆中平台游泳轨迹，记录小鼠在原平台象限的停留时间。
1.5 BrdU标记法及取材
处死动物前7 d，小鼠腹腔注射BrdU（50 mg/kg），每日1次，连续7 d。BrdU溶于含有0.28 g/L氢氧化钠的生理盐水，配制BrdU浓度为5 mg/mL。注射BrdU药物1周后第2日，麻醉脑组织取材，4%多聚甲醛固定，脱水，包埋，脑组织冠状冰冻切片（厚度30 μm），用于BrdU免疫组化检测。
1.6 免疫组化检测
脑切片复温30 min，PBS洗3次；3%H2O2封闭10 min；PBS洗3次。甲酰胺65 ℃水浴40 min抗原修复，PBS洗3次；2 mol/L盐酸37 ℃水浴40 min解开DNA双链，PBS洗3次；0.01 mmol/L Tris-HCL修复，PBS洗3次；滴加BrdU一抗（1∶4000），4 ℃冰箱保存。滴加Goat-anti-rat IgG（1∶400）二抗，室温孵育2 h；PBS洗3次；滴加ABC试剂（1∶400）三抗，室温孵育2 h；PBS洗3次；DAB显色，苏木素染核；脱水，透明，封片。镜下采集图像并计数，随机选5个视野观察，计数海马及海马周围BrdU阳性表达。
1.7 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示。采用方差分析，方差齐两两比较用LSD或SNK检验，方差不齐用秩和检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 补肾活血针刺法对SAMP8小鼠Morris水迷宫实验学习能力的影响
与正常组比较，模型组小鼠逃避潜伏期明显延长（P<0.05）；与模型组、非穴组比较，针刺组逃避潜伏期明显缩短（P<0.05）。结果见表1。
2.2 补肾活血针刺法对SAMP8小鼠Morris水迷宫实验记忆能力的影响
与正常组比较，模型组小鼠停留在原平台象限时间明显缩短（P<0.05）；与模型组、非穴组比较，针刺组小鼠停留在原平台象限时间明显延长（P<0.05）。结果见表2。
2.3 补肾活血针刺法对SAMP8小鼠海马内源性神经干细胞增殖的影响
免疫组化染色结果显示，海馬BrdU阳性表达主要分布在齿状回的颗粒细胞下层，BrdU阳性表达为细胞浆或细胞核为棕褐色或淡黄色，细胞呈散在分布，见图1。与正常组比较，模型组小鼠脑内海马BrdU阳性细胞数明显减少（P<0.05）；与模型组、非穴组比较，针刺组小鼠脑内海马BrdU阳性细胞数明显增加（P<0.05），见表3。
3 讨论
NSCs具有自我更新能力，正常情况下处于静止状态，受到刺激或病理情况下，其增殖能力增强，并可分化各种存在于动物胚胎中和成年人的中枢神经系统内的特殊神经细胞。内源性NSCs常多见于动物脑内的海马、纹状体、皮质、嗅球及侧脑室下区等部位。本研究采用BrdU标记法，其作为体现细胞增殖较为理想的指标，BrdU阳性细胞可看作增殖的内源性NSCs。BrdU标记时给药剂量太小，阳性细胞数量少、着色淡，因而不容易辨别，给药剂量太大则毒性大反而会减少阳性细胞数。有研究认为，BrdU给药剂量为50 mg/kg时，可保证摄取足够的BrdU数用于新生细胞DNA的合成[8]。本实验标记NSCs增殖的BrdU注射液剂量为50 mg/kg，切片经热抗原修复、DNA变性、解链后，目的细胞显色好，易于辨认计数，保证实验结果的准确可靠。 多项实验研究表明，针刺可改善老年痴呆模型动物的记忆和认知障碍[9-12]。本研究结果显示，隐蔽平台实验针刺组较模型组、非穴组逃避潜伏期明显缩短，空间探索实验针刺组小鼠停留在原平台象限时间较模型组、非穴位组明显延长，表明补肾活血针刺法刺激可改善AD模型SAMP8小鼠的学习记忆能力。BrdU免疫组化结果显示，针刺组小鼠脑内海马BrdU阳性细胞数较模型组、非穴组明显增加，表明补肾活血针刺法刺激可诱导AD模型SAMP8小鼠脑内内源性NSCs的增殖。
补肾活血为针刺法的选穴依据，百会是手少阳、足太阳、足少阳、足厥阴之交会穴，位于脑部巅顶处，是所有阳脉的交汇之处，内应于脑，是调节脑功能的要穴。有研究发现，电针“百会”可改善APP/PS1转基因小鼠的认知损伤[13]，提高APP/PS1双转基因AD模型小鼠的记忆能力[14]。肾俞位于足太阳膀胱经经脉上，有益肾固精、疏通经络、调节大脑的作用。膈俞为八会穴之血会，有活血功效，临床上常与血海配伍治疗多种血瘀病证。现代研究表明，电针“百会”“肾俞”“膈俞”对拟血管性痴呆小鼠的脑缺血缺氧及脑水肿状态有明显的改善作用[15]。血海为血证要穴，能补血活血。有研究发现，针刺“血海”可不同程度地影响大鼠血液高凝聚状态、血流状态及毛细血管状态，进而改善机体的微循环、新陈代谢及脏器功能的平衡等[16]。我们前期采用蛋白质组学的方法研究发现，以补肾活血为针刺法干预SAMP8小鼠可调节其杏仁核内相关氧化应激、线粒体能量等多种蛋白质的表达[17]。结合本实验结果，我们推测补肾活血针刺法可通过诱导脑内源性NSCs增殖而促进神经损伤修复、改善AD模型SAMP8小鼠的学习和记忆功能，进而为针灸治疗AD的研究提供新的思路和理论依据。
参考文献：
[1] FARR S A， PRICE T O， DOMINGUEZ L J， et al. MiR-195 dependent roles of mitofusin2 in the mitochondrial dysfunction of hippocampal neurons in SAMP8 mice[J]. J Alzheimers Dis，2012，28（1）：81-92.
[2] 朱宏，董克礼，吴岳.补肾活血法对阿尔茨海默病患者认知功能改善的影响[J].中国老年杂志，2010，30（11）：1493-1495.
[3] 戴思思，董克礼，朱宏.“补肾活血”针刺法对老年性痴呆模型SAMP8小鼠学习记忆能力和脑组织AChE活性的影响[J].上海针灸杂志，2010，29（1）：57-59.
[4] 朱宏，董克礼，李广城，等.“补肾活血”针刺法对SAMP8小鼠海马蛋白质表达的影响[J].中国老年学杂志，2011，31（23）：4613-4461.
[5] 李忠仁.实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社，2003：327.
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（收稿日期：2018-01-25）
（修回日期：2018-03-20；编辑：华强）
关键词：补肾活血；针刺；阿尔茨海默病；神经干细胞增殖；SAMP8小鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.009
中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）09-0035-04
Abstract： Objective To investigate the effects of Bushen Huoxue acupuncture method on the behavioral changes and the proliferation of endogenous neural stem cells （NSCs） in hippocampus of Alzheimer disease （AD） model mice. Methods 18 male SAMP8 mice， seven months old， were randomly divided into acupuncture group， non-acupoint control group， and model control group. And another age-matched 6 male SAMR1 mice were prepared as normal control group. Mice in acupuncture group were intervened by acupuncture method in the acupoints of “Shenshu”， “Baihui”， “Xuehai”， and “Geshu”. Mice in non-acupoint control group were treated by stimulating the fixed non-point under the bilateral rib， while mice in model control group and normal control group were raised without special treatment but administered the stimulation of catching with the same time and the same stimulus intensity. All treatrment lasted for 8 weeks. After the intervention， the learning and memory abilitities and brain hippocampus BrdU positive cells of all groups were detected. Results Compared with the nomal control group， mice in the model control group had longer escape latency and less time spent in former platform quadrant （P<0.05）； the number of BrdU positive cells decreased significantly （P<0.05）. Compared with the model control group and the non-acupoint control group， mice in the acupuncture group had shorter escape latency and more time spent in former platform quadrant （P<0.05）； the number of BrdU positive cells increased significantly （P<0.05）. Conclusion Bushen Huoxue acupuncture method can improve the learning and memory abilities of SAMP8 mice AD model by inducing the proliferation of hippocampal endogenous NSCs.
Keywords： Bushen Huoxue； acupuncture method； Alzheimer disease； NSCs proliferation； SAMP8 mice
阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种与年龄相关的复杂性神经性疾病，以认知功能进行性减退为特征[1]。本课题组前期研究发现，补肾活血法对AD认知障碍和病情发展有一定的控制作用[2]；补肾活血针刺法通过抗氧化应激、调节β淀粉样蛋白代谢、抑制神经反应及修复细胞骨架等方面的作用改善AD模型小鼠的学习记忆能力[3-4]。神经干细胞（neural stem cell，NSCs）是一类具有自我产生新细胞及分化能力的多能干细胞，其相关研究已成為神经学科领域热点。本实验在前期研究基础上，采用Morris水迷宫实验和免疫组化方法，观察补肾活血针刺法对AD模型SAMP8小鼠行为学及海马内源性NSCs增殖的影响。 1 材料与方法
1.1 动物及分组
清洁级雄性7月龄SAMP8小鼠18只、SAMR1小鼠6只，体质量（28±1.5）g，购于天津中医药大学第一附属医院动物实验中心，动物质量合格证号0001353。饲养于中南大学湘雅三医院实验动物中心，温度20～23 ℃，相对湿度55%～58%，每日12 h照明，自由摄食饮水，单笼通气通风。所有小鼠适应性饲养7 d，AD模型SAMP8小鼠随机分为针刺组、非穴组和模型组，每组6只，6只SAMR1小鼠为正常组。
1.2 主要试剂与仪器
BrdU粉末，美国Sigma；Rat-anti-BrdU，美国Serotec；Goat-anti-rat IgG，德国Vector Laboratories；ABC试剂，德国Vector Laboratories。移液枪，美国Eppendoff；0.30 mm×25 mm华佗牌一次性针灸针，苏州医疗用品厂有限公司；Morris水迷宫，中南大学湘雅三医院动物实验中心；光学显微镜及彩色图像分析系统，日本Olympus。
1.3 干预
针刺组用补肾活血针刺法进行干预，选取“百会”（顶骨正中，即头顶两耳根连线的中点）、“血海”（后肢股内侧中间，髌底内侧端至耻骨联合连线下1/9处）、“肾俞”（第2腰椎下两旁）及“膈俞”（第7胸椎下两旁肋间）。“百会”向前平刺3～4 mm，施捻转平补平泻法；“肾俞”直刺2～3 mm，施捻转补法；“血海”直刺2～3 mm，施捻转泻法；“膈俞”以80°角斜向上刺2～3 mm，施捻转泻法。每个施针穴位间歇5 min，捻转1次。其中“肾俞”“膈俞”“血海”先针刺左侧，隔日再针刺右侧。小鼠穴位定位及针刺深度均参照“动物针灸穴位图谱”[5]。补泻手法参照石学敏院士制定的针刺手法量学标准，即针刺后开始捻转时拇指向顺时针捻转为补，逆时针则为泻[6]。非穴组参照韩景献教授经验采取针刺双侧胁下固定非穴位点作为对照刺激点，斜刺进针2～3 mm，用平补平泻捻转手法进行干预，先针刺左侧，隔日再针刺右侧[7]。模型组和正常组每日参照针刺组以同样方式和程度、在相同时间进行抓取和固定。各组小鼠每日处理1次，连续6 d，第7日休息，连续8周。
1.4 行为学检测
干预结束后采用Morris水迷宫实验进行行为学测试。隐蔽平台实验：将平台放置于第2象限，将小鼠置于平台15 s，并依次从第1、3、4象限入水点投放小鼠，记录该鼠找到平台的时间，即为逃避潜伏期。如小鼠超过60 s尚未找到平台，则由实验者将小鼠引至平台，并让小鼠在平台上停留15 s，逃避潜伏期记为60 s。空间探索实验：撤去平台，由第4象限入水，观察小鼠60 s内无平台条件下寻找记忆中平台游泳轨迹，记录小鼠在原平台象限的停留时间。
1.5 BrdU标记法及取材
处死动物前7 d，小鼠腹腔注射BrdU（50 mg/kg），每日1次，连续7 d。BrdU溶于含有0.28 g/L氢氧化钠的生理盐水，配制BrdU浓度为5 mg/mL。注射BrdU药物1周后第2日，麻醉脑组织取材，4%多聚甲醛固定，脱水，包埋，脑组织冠状冰冻切片（厚度30 μm），用于BrdU免疫组化检测。
1.6 免疫组化检测
脑切片复温30 min，PBS洗3次；3%H2O2封闭10 min；PBS洗3次。甲酰胺65 ℃水浴40 min抗原修复，PBS洗3次；2 mol/L盐酸37 ℃水浴40 min解开DNA双链，PBS洗3次；0.01 mmol/L Tris-HCL修复，PBS洗3次；滴加BrdU一抗（1∶4000），4 ℃冰箱保存。滴加Goat-anti-rat IgG（1∶400）二抗，室温孵育2 h；PBS洗3次；滴加ABC试剂（1∶400）三抗，室温孵育2 h；PBS洗3次；DAB显色，苏木素染核；脱水，透明，封片。镜下采集图像并计数，随机选5个视野观察，计数海马及海马周围BrdU阳性表达。
1.7 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示。采用方差分析，方差齐两两比较用LSD或SNK检验，方差不齐用秩和检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 补肾活血针刺法对SAMP8小鼠Morris水迷宫实验学习能力的影响
与正常组比较，模型组小鼠逃避潜伏期明显延长（P<0.05）；与模型组、非穴组比较，针刺组逃避潜伏期明显缩短（P<0.05）。结果见表1。
2.2 补肾活血针刺法对SAMP8小鼠Morris水迷宫实验记忆能力的影响
与正常组比较，模型组小鼠停留在原平台象限时间明显缩短（P<0.05）；与模型组、非穴组比较，针刺组小鼠停留在原平台象限时间明显延长（P<0.05）。结果见表2。
2.3 补肾活血针刺法对SAMP8小鼠海马内源性神经干细胞增殖的影响
免疫组化染色结果显示，海馬BrdU阳性表达主要分布在齿状回的颗粒细胞下层，BrdU阳性表达为细胞浆或细胞核为棕褐色或淡黄色，细胞呈散在分布，见图1。与正常组比较，模型组小鼠脑内海马BrdU阳性细胞数明显减少（P<0.05）；与模型组、非穴组比较，针刺组小鼠脑内海马BrdU阳性细胞数明显增加（P<0.05），见表3。
3 讨论
NSCs具有自我更新能力，正常情况下处于静止状态，受到刺激或病理情况下，其增殖能力增强，并可分化各种存在于动物胚胎中和成年人的中枢神经系统内的特殊神经细胞。内源性NSCs常多见于动物脑内的海马、纹状体、皮质、嗅球及侧脑室下区等部位。本研究采用BrdU标记法，其作为体现细胞增殖较为理想的指标，BrdU阳性细胞可看作增殖的内源性NSCs。BrdU标记时给药剂量太小，阳性细胞数量少、着色淡，因而不容易辨别，给药剂量太大则毒性大反而会减少阳性细胞数。有研究认为，BrdU给药剂量为50 mg/kg时，可保证摄取足够的BrdU数用于新生细胞DNA的合成[8]。本实验标记NSCs增殖的BrdU注射液剂量为50 mg/kg，切片经热抗原修复、DNA变性、解链后，目的细胞显色好，易于辨认计数，保证实验结果的准确可靠。 多项实验研究表明，针刺可改善老年痴呆模型动物的记忆和认知障碍[9-12]。本研究结果显示，隐蔽平台实验针刺组较模型组、非穴组逃避潜伏期明显缩短，空间探索实验针刺组小鼠停留在原平台象限时间较模型组、非穴位组明显延长，表明补肾活血针刺法刺激可改善AD模型SAMP8小鼠的学习记忆能力。BrdU免疫组化结果显示，针刺组小鼠脑内海马BrdU阳性细胞数较模型组、非穴组明显增加，表明补肾活血针刺法刺激可诱导AD模型SAMP8小鼠脑内内源性NSCs的增殖。
补肾活血为针刺法的选穴依据，百会是手少阳、足太阳、足少阳、足厥阴之交会穴，位于脑部巅顶处，是所有阳脉的交汇之处，内应于脑，是调节脑功能的要穴。有研究发现，电针“百会”可改善APP/PS1转基因小鼠的认知损伤[13]，提高APP/PS1双转基因AD模型小鼠的记忆能力[14]。肾俞位于足太阳膀胱经经脉上，有益肾固精、疏通经络、调节大脑的作用。膈俞为八会穴之血会，有活血功效，临床上常与血海配伍治疗多种血瘀病证。现代研究表明，电针“百会”“肾俞”“膈俞”对拟血管性痴呆小鼠的脑缺血缺氧及脑水肿状态有明显的改善作用[15]。血海为血证要穴，能补血活血。有研究发现，针刺“血海”可不同程度地影响大鼠血液高凝聚状态、血流状态及毛细血管状态，进而改善机体的微循环、新陈代谢及脏器功能的平衡等[16]。我们前期采用蛋白质组学的方法研究发现，以补肾活血为针刺法干预SAMP8小鼠可调节其杏仁核内相关氧化应激、线粒体能量等多种蛋白质的表达[17]。结合本实验结果，我们推测补肾活血针刺法可通过诱导脑内源性NSCs增殖而促进神经损伤修复、改善AD模型SAMP8小鼠的学习和记忆功能，进而为针灸治疗AD的研究提供新的思路和理论依据。
参考文献：
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（收稿日期：2018-01-25）
（修回日期：2018-03-20；编辑：华强）