HPLC法同时测定消癌平片中通关藤苷A和通关藤苷I的含量

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  中图分类号 R284.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408(2018)13-1790-04
  DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.13.15
  摘 要 目的:建立同时测定消癌平片中通关藤苷A和通关藤苷I含量的方法。方法:取消癌平片经三氯甲烷萃取后采用高效液相色谱(HPLC)法进样分析。色谱柱为Symmetry C18,流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液(梯度洗脱),检测波长为223 nm,流速为1.0 mL/min,柱温为25 ℃,进样量为20 μL。采用上述条件测定3批样品中通关藤苷A和通关藤苷I的含量。结果:通关藤苷A、通关藤苷I的质量浓度检测线性范围分别为26.40~264.00 μg/mL(r=0.999 4)、4.59~45.90 μg/mL(r=0.999 3),检测限分别为0.26、0.12 μg/mL,定量限分别为0.79、0.36 μg/mL;精密度、稳定性(12 h)、重复性试验峰面积的RSD均<2.0%(n=6);加样回收率分别为98.53%~99.28%(RSD为0.20%~0.51%,n=9)、97.00%~98.89%(RSD为0.19%~1.03%,n=9)。3批样品中通关藤苷A和通关藤苷I的含量分别为2.27~2.32、0.64~0.69 mg/g。结论:本试验建立的方法简便,结果准确可靠,适用于消癌平片中通关藤苷A和通关藤苷I含量的同时测定。
  关键词 高效液相色谱法; 消癌平片; 通关藤苷A; 通关藤苷I;含量测定
  ABSTRACT OBJECTIVE: To develop a method for simultaneous determination of tenacissoside A and tenacissoside I in Xiaoaiping tablets. METHODS: HPLC method was used to analyze Xiaoaiping tablets after extracted by trichlormethane. The determination was performed in Symmetry C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution (gradient elution) at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 223 nm, and the column temperature was 25 ℃. The sample size was 20 μL. The content of tenacissoside A and tenacissoside I in 3 batches of samples were determined by above condition. RESULTS: The linear range of tenacissoside A and tenacissoside I were 26.40-264.00 μg/mL (r=0.999 4) and 4.59-45.90 μg/mL (r=0.999 3), respectively. The limits of detection were 0.26, 0.12 μg/mL, and the limits of quantification were 0.79, 0.36 μg/mL. RSDs of precision, stability (12 h) and repeatability tests were all lower than 2.0%(n=6). The recoveries were 98.53%-99.28% (RSD=0.20%-0.51%,n=9) and 97.00%-98.89% (RSD=0.19%-1.03%,n=9). The contents of tenacissoside A and tenacissoside I in 3 batches of samples were 2.27-2.32 mg/g and 0.64-0.69 mg/g, respectively. CONCLUSIONS: The established method is accurate, simple and reliable, which is suitable for simultaneous determination of tenacissoside A and tenacissoside I in Xiaoaiping tablets.
  KEYWORDS HPLC; Xiaoaiping tablets; Tenacissoside A; Tenacissoside I; Content determination
  消癌平片為通关藤单味药材提取所制,具有抗癌、消炎、平喘的功效,临床主要用于单独或配合放、化疗及手术后的肝癌、食管癌、胃癌、肺癌等恶性肿瘤[1-6]的治疗,其制剂质量标准中仅以绿原酸为测定指标[7],代表性不足。参考文献[8-9],笔者采用高效液相色谱(HPLC)法测定消癌平片中抗肿瘤主要活性成分通关藤苷A和通关藤苷I的含量,以便对消癌平片质量进行更全面、准确、简便的控制。通关藤苷A和通关藤苷I结构式见图1。
  1 材料
  1.1 仪器
  2695HPLC仪,包括2487紫外检测器、E2695四元梯度泵、Empower3分析软件、自动进样器(美国Waters公司);AB204-S分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司);KQ3200超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。   1.2 药品与试剂
  消癌平片(长春银诺克药业有限公司,批号:20160601、20160411、20160508,规格:0.3 g/片);通关藤苷A对照品(山西省中医药研究院,批号:20130513,纯度:>98%);通关藤苷I对照品(深圳远扬生物技术有限公司,批号:20160311,纯度:>98%);甲醇和乙腈均为色谱纯,其余试剂为分析纯,水为纯化水。
  2 方法与结果
  2.1 色谱条件
  色谱柱:Symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B),梯度洗脱(0~10 min,32%A;10~10.01 min,32%→42%A;10.01~15 min,42%A;15~15.01 min,42%→50%A;15.01~28 min,50%A);检测波长:223 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:25 ℃;进样量:20 μL。
  2.2 溶液的制备
  2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称取通关藤苷A对照品和通关藤苷I对照品33.02、22.01 mg,分别置于10 mL量瓶中,用甲醇溶解并定容,摇匀,制得对照品溶液Ⅰ(通关藤苷A质量浓度为3.30 mg/mL)及对照品溶液Ⅱ(通关藤苷I质量浓度为2.20 mg/mL)。取对照品溶液Ⅰ8 mL、对照品溶液Ⅱ1.7 mL,置于同一10 mL量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀,即得混合对照品溶液。
  2.2.2 供试品溶液 取消癌平片,去除糖衣,研细,即得消癌平片粉末。精密称取消癌平片粉末0.55 g,置于60 mL分液漏斗中,加入三氯甲烷6 mL,纯化水24 mL,摇匀,静置。取有机层,连续萃取3次,将所制得溶液蒸干,用甲醇复溶并定容至10 mL量瓶中,0.22 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
  2.2.3 空白对照溶液 称取生产厂家处方中所添加各种辅料适量,按“2.2.2”项下方法制备空白对照溶液。
  2.3 系统适用性试验
  精密量取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液、空白对照溶液各适量,按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱。结果,在该色谱条件下,各待测成分间、待测成分与杂质峰间均能达到基线分离,分离度>1.5,色谱图见图2。
  2.4 线性关系考察
  取“2.2.1”项下混合对照品溶液20、40、80、120、160、200 μL,分别置于2 mL量瓶中,加甲醇定容,摇匀,制成系列混合对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录峰面积。以待测成分质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)进行线性回归,得通关藤苷A和通关藤苷I的回归方程分别为y=9 499.8x+9 251.30(r=0.999 4)、y=13 770x-3 764.40(r=0.999 3)。结果表明,通关藤苷A和通关藤苷I的检测质量浓度线性范围分别为26.40~264.00、4.59~45.90 μg/mL。
  2.5 檢测限与定量限考察
  取“2.2.1”项下混合对照品溶液倍比稀释,按“2.1”项下色谱条件进样测定。当信噪比为3 ∶ 1时,得检测限;当信噪比为10 ∶ 1时,得定量限。结果表明,通关藤苷A的检测限和定量限分别为0.26、0.79 μg/mL,通关藤苷I的检测限和定量限分别为0.12、0.36 μg/mL。
  2.6 精密度试验
  取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量,按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次,每次20 μL,记录峰面积。结果显示,通关藤苷A和通关藤苷I峰面积的RSD分别为0.36%、0.52%(n=6),表明仪器精密度良好。
  2.7 稳定性试验
  取供试品溶液(批号:20160601)适量,分别于室温下放置0、1、2、4、8、12 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录峰面积。结果显示,通关藤苷A和通关藤苷I峰面积的RSD分别为0.26%、0.17%(n=6),表明供试品溶液在室温下放置12 h内稳定性良好。
  2.8 重复性试验
  取消癌平片(批号:20160601)粉末,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,共6份,按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录峰面积。结果显示,通关藤苷A和通关藤苷I峰面积的RSD分别为1.05%、1.45%(n=6),表明本方法重复性良好。
  2.9 加样回收率试验
  取消癌平片(批号:20160601)粉末,共9份,每份约0.30 mg,精密称定,分别置于25 mL分液漏斗中,各加入低、中、高质量的待测成分对照品,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,再按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录峰面积并计算加样回收率。结果显示,通关藤苷A和通关藤苷I加样回收率分别为98.53%~99.28%(RSD为0.20%~0.51%,n=9)、97.00%~98.89%(RSD为0.19%~1.03%,n=9),表明方法准确度较高。加样回收率试验结果见表1。
  2.10 样品含量测定
  取3批样品各适量,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,再按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录峰面积并计算含量。结果,消癌平片中通关藤苷A和通关藤苷I含量分别为2.27~2.32、0.64~0.69 mg/g,样品含量测定结果见表2。
  3 讨论
  3.1 检测方法的选择
  笔者在前期试验中采用超高效液相色谱-串联质谱法建立了同时测定通关藤药材中3种皂苷通关藤苷A、H、I的含量[10]。由于消癌平片为通关藤经水多次煎煮浓缩而成,其各成分含量理论比药材中高。本试验参考文献[11-12]建立了较为普适的HPLC-紫外检测器法的条件,对消癌平片中2种活性成分通关藤苷A和通关藤苷I进行了含量测定,结果显示,此方法能准确、灵敏地对2种成分进行定性、定量分析。   3.2 质量控制指标的选择
  消癌平中含有C21甾体皂苷类、三萜类、多糖类、酚酸类等化学成分[8-9]。绿原酸存在于金银花、杜仲等多种中药植物中,对通关藤及消癌平的研究多集中在绿原酸等酚酸类成分,如谢丽艳、张阿琴等[13-14]报道消癌平注射液中绿原酸、咖啡酸、香草酸等酚酸类成分的含量测定方法。通关藤及消癌平抗肿瘤主要活性成分为C21甾体皂苷(即通关藤苷及其苷元),目前从通关藤中鉴定分离出50多种通关藤苷及其苷元[15],对其成分功效的研究还处于初步阶段。通关藤苷不仅对人胃癌细胞SGC-7901、小鼠肉瘤细胞S180、小鼠淋巴细胞性白血病细胞P388有显著的体内抑制作用[16],还可以抑制肝癌细胞增殖,使甲胎蛋白分泌量降低[17],对对乙酰氨基酚诱导的肝损伤也具有一定的保护作用,其机制可能与其减少自由基产生、提高抗氧化物酶活性有關[18]。2015年版《中国药典》(一部)[1]关于通关藤的含量测定引入了通关藤苷H指标成分,在消癌平注射液质量标准[19]中含量测定引入了通关藤苷A指标成分。本研究在参照国家质量标准[7,19]基础上,结合预试验结果选择了含量较高的通关藤苷A和通关藤苷I[11-12]作为质量控制指标。
  3.3 色谱条件的选择
  3.3.1 检测波长 通关藤苷A和通关藤苷I属于C21甾体皂苷类化合物,是一类苷元为孕甾烷衍生物与2-脱氧糖等形成的苷,在紫外末端有吸收。文献报道,通关藤苷A和通关藤苷I的最大吸收波长分别为223 nm[1]和230 nm[11]。笔者在选择检测波长时发现,在223 nm波长处通关藤苷A和通关藤苷I峰形均良好。因此,选择223 nm为检测波长。
  3.3.2 流动相 笔者在预试验中曾用乙腈和水等度洗脱,通关藤苷A和通关藤苷I色谱峰的分离度小于1.5,而选用乙腈和磷酸溶液梯度洗脱后,30 min内即可完成对样品的分析,通关藤苷A和通关藤苷I均能得到较好的峰形及分离度大于1.5,故本试验最终采用乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相并进行梯度洗脱。
  综上所述,本研究建立的方法简便,结果准确可靠,适用于消癌平片中通关藤苷A和通关藤苷I含量的同时测定。
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  (收稿日期:2018-03-01 修回日期:2018-05-22)
  (编辑:余庆华)
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