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摘 要 线虫群落组成可作为评估土壤环境质量的一个重要指标。分子生物学手段为解决传统形态学鉴定进行群落组成分析工作量较大，专业知识需求高，鉴定结果的一致性易受干扰等问题提供了新途径，并具有样品量小，检测速度快，对近缘种区分度高等特点。
关键词 线虫多样性；高通量测序；DGGE；分子生物学；遗传标记
中图分类号：S154 文献标志码：B 文章编号：1673-890X（2016）15--02
线虫在土壤食物网中占据较为重要的地位，常以土壤微生物为食，在土壤有机质分解、养分循环、改善土壤结构以及植物演替中发挥着重要的作用，其群落组成的变化能够反映所在生态系统的健康状况[1]。
传统的线虫群落结构研究基于对土壤中线虫的人工分离和形态学鉴定，往往需要研究者具备专业的分类学知识，同时耗费大量的时间和精力。而且，由于线虫个体较小，物种的分类比较粗糙，往往只到科属水平，使生态分析比较模糊或表面化。此外，由于提取方法和形态学分类依据的限制，科属鉴定只能针对从土壤中获取的很小一部分成年线虫个体，很难反映全部土壤线虫的状态，且易受环境和人为因素的干扰，可能使后续群落结构和区系分析结果在平行试验结果间缺乏一致性。
针对遗传物质的分子生物学方法在分类学上的引入为解决问题提供了新的方法和思路。不同于传统的形态学鉴定对常规物种描述性的评估，采用分子生物学方法能针对少量样品进行分析，降低了劳动强度和对分类学专业知识的要求，提高了效率。此外，分子生物学技术也可以更容易地鉴定亲缘种[2]，提高了研究的精度。本文针对线虫群落结构分析中分子生物学的研究应用现状进行概述，分析了各种方法的利弊，为线虫分子生态学研究提供参考。
1 利用分子生物学方法对线虫群落的分析
1.1 DNA条形码技术
DNA条形码技术能利用相对较短的标准DNA片段，进行种内特异性与种间多样性的生物身份建立，实现了对物种快速、准确进行识别和鉴定[3]，可用于与生物分类相关的生态学、保护生物学等领域。基于DNA条形码技术的线虫分类学研究已经引起人们的关注。许多遗传标记（Genetic Markers）已被用于线虫的鉴定，包括SSU rDNA、LSU rDNA、ITS序列、COI等。
小亚基核糖体DNA（The ribosomal DNA small subunit，SSU rDNA）是最早用于标记的片段，目前应用较广泛。它能有效描述某些线虫但不能完全解释形态学研究观察到的结果。对于线虫目和科水平的鉴定效果较好，但某些线虫种无法用SSU进行区分。后来，人们尝试用大亚基核糖体DNA（The ribosomal DNA large subunit ，LSU rDNA），但它需要多个区域的扩增是有效的。利用核糖体DNA内转录间隔区（The internal transcribed spacer，ITS）建立线虫系统发育分类系统。线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（Cyctochromec oxidase subunit I，COI）具有引物通用性高和进化速率快等优点，用于动物分类鉴定较为理想。当然，利用以上遗传标记的条形码技术都一些问题，如缺少同门范围（phylum-wide）内的引物，很难找到适宜用做条形码的单一基因片段以鉴定全球范围内的线虫种类，进而建立高通量测序的方法等。
1.2 PCR-DGGE
变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gelelectrophoresis，DGGE）利用不同核酸序列或基因片段在变性梯度胶上电泳迁移率的不同将序列分开，可以直接切下凝胶条带测序，进行群落内的系统发育分析。有研究探讨使用PCR-DGGE法分析线虫群落组成。Waite[4]等从草地土壤中直接提取环境DNA，针对SSU 18S rDNA序列，采用PCR-DGGC法研究土壤线虫群落的多样性，并获得了某些属线虫的特异序列。但发现结果与之前进行的基于形态学分类的研究结果不一致。并且，从结果很难获取有关的遗传多样性或任何特定的类群的相对丰度的信息。Wang[5]等采用该法和形态学鉴定相结合的方法对铜污染土壤中线虫多样性进行分析，结果表明，PCR-DGGE法对判别重金属污染土壤中线虫多样性具有可行性。但PCR-DGGE法存在一些缺点，如PCR引物可能存在扩增的局限性；分离的DNA片段较小（最大为1 kb），序列信息有限；在不适宜的实验条件下，序列不同DNA片段不能完全分开；只能检测到环境中的优势种群等。
1.3 PCR-TRLFP
末端限制性片段长度多态性分析（Terminal restriction fragment length polymorphism，TRFLP），在PCR扩增基础上，根据限制性酶切片段长度差异来检测生物群落差异的一种指纹分析方法。该方法可用于不同生境的线虫群落研究。目前，已针对草地、农田、沙丘、森林及沼泽地等生态系统开展了相应研究[6-8]，并获得了较理想的结果。TRFLP最主要的优点是能够在不同序列运行中比较数据，不像DGGE在凝胶之间比较。片段可以被精确地控制在700bp左右；超过这个规定的相关片段可以被控制在1000bp大小，分辨率相对较高。在96或384孔板可以进行TRFLP，加上电子数据输出和自动自如，这意味着它是高通量与快速数据分析结合的方法。但是由于限制性酶对扩增产物酶切得不完全，会存在高估生物群落的多样性。
1.4 高通量测序
高通量测序在微生物生态学研究中已经取得了比较理想的结果。因此，有研究者将该方法引入线虫多样性的研究中。近几年，二代测序技术（The next-generation sequencing，NGS），特别是454测序在线虫多样性研究方面取得了长足进展，定性或定量研究中，高通量测序结果都有比较好的一致性和重现性[9]。但也存在一些问题，例如，虽然线虫的优势种和常见种易被检测，特定种属的信息更加丰富，但还不能完全反映线虫群落组成。现有引物不具有线虫专一性，同时还会扩增出真菌、植物或其他后生动物的信息，易对聚类分析产生干扰。针对SSU rDNA的研究发现，先对土壤样品中线虫进行分离提取再进行测序，可以降低真菌或植物OUTs的干扰，但会使聚类结果偏向某些定的种属或特定生长阶段的线虫；而直接从土壤中获取线虫DNA，又对引物的特异性有较高要求[10]。因此，线虫DNA的提取方法，遗传标价通用引物的选择是下一步研究亟待解决的问题。 2 结语
虽然存在局限性，但分子生物学手段的应用拓宽了线虫学研究的广度和深度。有报道表明，传统分类学与分子方法对于线虫多样性的研究结果的缺乏一致性，因此，建立传统分类方法与分子方法的对应关系是研究的一个关键点，分子技术要能反映特定种或某功能团的相对多度。此外，高通量测序可以实现同时对多个土样样品的土壤线虫进行大规模分析，但目前方法尚不成熟，未来基于遗传标记的高通量基因组研究将线虫生态学的发展方向之一。传统分类学是分子手段的基础，分子方法对大样本的分析更加简便，二者彼此促进，必将推动土壤线虫分类学及群落研究的发展。
参考文献
[1]Wardle， D.A..Ecological Linkages Between Aboveground and Belowground Biota[J]. Science， 2004，304（5677）：1629-1633.
[2]PowersT. Nematode molecular diagnostics： from bands to barcodes[J].Annu Rev Phytopathol， 2004（42）：367-383.
[3]Hebert， P.D.N..Biological identifications through DNA barcodes[J]. Proceedings of the Royal Society B： Biological Sciences，2003，270（1512）：313-321.
[4]Waite， I.S. Design and Evaluation of Nematode 18S rDNAPrimers for PCR and Denaturing Gradient gel Electrophoresis （DGGE） of Soil Community DNA[J].Soil Biology and Biochemistry，2003，35（9）：1165-1173.
[5]WANG， S.PCR-DGGE Analysis of Nematode Diversity in Cu-Contaminated Soil*1[J].Pedosphere， 2008，18（5）：621-627.
[6]Donn， S.DNA Extraction from Soil Nematodes for Multi-sample Community Studies[J].Applied Soil Ecology，2008，38（1）：20-26.
[7]Palomares-Rius， J.E. Nematode Community Populations in the Rhizosphereof Cultivated Olive Differs According to the Plant Genotype[J].Soil Biology and Biochemistry，2012（9）：168-171.
[8]Donn， S. A Novel Molecular Approach for Rapid Assessment of Soil Nematode Assemblages-variation， Validation and Potential Applications[J].Methods in Ecology and Evolution，2012，3（1）：12-23.
[9]Porazinska D.L. Reproducibility of Readnumbersin High-throughput Sequencing Analysis of Nematode Communitycompositionand Structure[J].MolEcolResour，2010（10）：666-676.
[10]Sapkota R.High-throughput Sequencing of Nematode Communities from Total Soil DNA Extractions[J].BMC Ecology，2015，15（1）：1-8.
（责任编辑：刘昀）
关键词 线虫多样性；高通量测序；DGGE；分子生物学；遗传标记
中图分类号：S154 文献标志码：B 文章编号：1673-890X（2016）15--02
线虫在土壤食物网中占据较为重要的地位，常以土壤微生物为食，在土壤有机质分解、养分循环、改善土壤结构以及植物演替中发挥着重要的作用，其群落组成的变化能够反映所在生态系统的健康状况[1]。
传统的线虫群落结构研究基于对土壤中线虫的人工分离和形态学鉴定，往往需要研究者具备专业的分类学知识，同时耗费大量的时间和精力。而且，由于线虫个体较小，物种的分类比较粗糙，往往只到科属水平，使生态分析比较模糊或表面化。此外，由于提取方法和形态学分类依据的限制，科属鉴定只能针对从土壤中获取的很小一部分成年线虫个体，很难反映全部土壤线虫的状态，且易受环境和人为因素的干扰，可能使后续群落结构和区系分析结果在平行试验结果间缺乏一致性。
针对遗传物质的分子生物学方法在分类学上的引入为解决问题提供了新的方法和思路。不同于传统的形态学鉴定对常规物种描述性的评估，采用分子生物学方法能针对少量样品进行分析，降低了劳动强度和对分类学专业知识的要求，提高了效率。此外，分子生物学技术也可以更容易地鉴定亲缘种[2]，提高了研究的精度。本文针对线虫群落结构分析中分子生物学的研究应用现状进行概述，分析了各种方法的利弊，为线虫分子生态学研究提供参考。
1 利用分子生物学方法对线虫群落的分析
1.1 DNA条形码技术
DNA条形码技术能利用相对较短的标准DNA片段，进行种内特异性与种间多样性的生物身份建立，实现了对物种快速、准确进行识别和鉴定[3]，可用于与生物分类相关的生态学、保护生物学等领域。基于DNA条形码技术的线虫分类学研究已经引起人们的关注。许多遗传标记（Genetic Markers）已被用于线虫的鉴定，包括SSU rDNA、LSU rDNA、ITS序列、COI等。
小亚基核糖体DNA（The ribosomal DNA small subunit，SSU rDNA）是最早用于标记的片段，目前应用较广泛。它能有效描述某些线虫但不能完全解释形态学研究观察到的结果。对于线虫目和科水平的鉴定效果较好，但某些线虫种无法用SSU进行区分。后来，人们尝试用大亚基核糖体DNA（The ribosomal DNA large subunit ，LSU rDNA），但它需要多个区域的扩增是有效的。利用核糖体DNA内转录间隔区（The internal transcribed spacer，ITS）建立线虫系统发育分类系统。线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（Cyctochromec oxidase subunit I，COI）具有引物通用性高和进化速率快等优点，用于动物分类鉴定较为理想。当然，利用以上遗传标记的条形码技术都一些问题，如缺少同门范围（phylum-wide）内的引物，很难找到适宜用做条形码的单一基因片段以鉴定全球范围内的线虫种类，进而建立高通量测序的方法等。
1.2 PCR-DGGE
变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gelelectrophoresis，DGGE）利用不同核酸序列或基因片段在变性梯度胶上电泳迁移率的不同将序列分开，可以直接切下凝胶条带测序，进行群落内的系统发育分析。有研究探讨使用PCR-DGGE法分析线虫群落组成。Waite[4]等从草地土壤中直接提取环境DNA，针对SSU 18S rDNA序列，采用PCR-DGGC法研究土壤线虫群落的多样性，并获得了某些属线虫的特异序列。但发现结果与之前进行的基于形态学分类的研究结果不一致。并且，从结果很难获取有关的遗传多样性或任何特定的类群的相对丰度的信息。Wang[5]等采用该法和形态学鉴定相结合的方法对铜污染土壤中线虫多样性进行分析，结果表明，PCR-DGGE法对判别重金属污染土壤中线虫多样性具有可行性。但PCR-DGGE法存在一些缺点，如PCR引物可能存在扩增的局限性；分离的DNA片段较小（最大为1 kb），序列信息有限；在不适宜的实验条件下，序列不同DNA片段不能完全分开；只能检测到环境中的优势种群等。
1.3 PCR-TRLFP
末端限制性片段长度多态性分析（Terminal restriction fragment length polymorphism，TRFLP），在PCR扩增基础上，根据限制性酶切片段长度差异来检测生物群落差异的一种指纹分析方法。该方法可用于不同生境的线虫群落研究。目前，已针对草地、农田、沙丘、森林及沼泽地等生态系统开展了相应研究[6-8]，并获得了较理想的结果。TRFLP最主要的优点是能够在不同序列运行中比较数据，不像DGGE在凝胶之间比较。片段可以被精确地控制在700bp左右；超过这个规定的相关片段可以被控制在1000bp大小，分辨率相对较高。在96或384孔板可以进行TRFLP，加上电子数据输出和自动自如，这意味着它是高通量与快速数据分析结合的方法。但是由于限制性酶对扩增产物酶切得不完全，会存在高估生物群落的多样性。
1.4 高通量测序
高通量测序在微生物生态学研究中已经取得了比较理想的结果。因此，有研究者将该方法引入线虫多样性的研究中。近几年，二代测序技术（The next-generation sequencing，NGS），特别是454测序在线虫多样性研究方面取得了长足进展，定性或定量研究中，高通量测序结果都有比较好的一致性和重现性[9]。但也存在一些问题，例如，虽然线虫的优势种和常见种易被检测，特定种属的信息更加丰富，但还不能完全反映线虫群落组成。现有引物不具有线虫专一性，同时还会扩增出真菌、植物或其他后生动物的信息，易对聚类分析产生干扰。针对SSU rDNA的研究发现，先对土壤样品中线虫进行分离提取再进行测序，可以降低真菌或植物OUTs的干扰，但会使聚类结果偏向某些定的种属或特定生长阶段的线虫；而直接从土壤中获取线虫DNA，又对引物的特异性有较高要求[10]。因此，线虫DNA的提取方法，遗传标价通用引物的选择是下一步研究亟待解决的问题。 2 结语
虽然存在局限性，但分子生物学手段的应用拓宽了线虫学研究的广度和深度。有报道表明，传统分类学与分子方法对于线虫多样性的研究结果的缺乏一致性，因此，建立传统分类方法与分子方法的对应关系是研究的一个关键点，分子技术要能反映特定种或某功能团的相对多度。此外，高通量测序可以实现同时对多个土样样品的土壤线虫进行大规模分析，但目前方法尚不成熟，未来基于遗传标记的高通量基因组研究将线虫生态学的发展方向之一。传统分类学是分子手段的基础，分子方法对大样本的分析更加简便，二者彼此促进，必将推动土壤线虫分类学及群落研究的发展。
参考文献
[1]Wardle， D.A..Ecological Linkages Between Aboveground and Belowground Biota[J]. Science， 2004，304（5677）：1629-1633.
[2]PowersT. Nematode molecular diagnostics： from bands to barcodes[J].Annu Rev Phytopathol， 2004（42）：367-383.
[3]Hebert， P.D.N..Biological identifications through DNA barcodes[J]. Proceedings of the Royal Society B： Biological Sciences，2003，270（1512）：313-321.
[4]Waite， I.S. Design and Evaluation of Nematode 18S rDNAPrimers for PCR and Denaturing Gradient gel Electrophoresis （DGGE） of Soil Community DNA[J].Soil Biology and Biochemistry，2003，35（9）：1165-1173.
[5]WANG， S.PCR-DGGE Analysis of Nematode Diversity in Cu-Contaminated Soil*1[J].Pedosphere， 2008，18（5）：621-627.
[6]Donn， S.DNA Extraction from Soil Nematodes for Multi-sample Community Studies[J].Applied Soil Ecology，2008，38（1）：20-26.
[7]Palomares-Rius， J.E. Nematode Community Populations in the Rhizosphereof Cultivated Olive Differs According to the Plant Genotype[J].Soil Biology and Biochemistry，2012（9）：168-171.
[8]Donn， S. A Novel Molecular Approach for Rapid Assessment of Soil Nematode Assemblages-variation， Validation and Potential Applications[J].Methods in Ecology and Evolution，2012，3（1）：12-23.
[9]Porazinska D.L. Reproducibility of Readnumbersin High-throughput Sequencing Analysis of Nematode Communitycompositionand Structure[J].MolEcolResour，2010（10）：666-676.
[10]Sapkota R.High-throughput Sequencing of Nematode Communities from Total Soil DNA Extractions[J].BMC Ecology，2015，15（1）：1-8.
（责任编辑：刘昀）