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摘 要：采用超高压液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）检测了水产品中呋喃它酮（AMOZ）、呋喃西林（SEM）、呋喃妥因（AHD）和呋喃唑酮（AOZ）4种硝基呋喃代谢物的残留量。样品用盐酸溶液水解，用2-硝基苯甲醛衍生化，采用乙酸乙酯液-液萃取净化，初始流动相复溶后，经C18液相色谱柱分离，ESI电离源串联三重四级杆质谱仪以多反应监测扫描模式（MRM）进行检测分析，内标法定量。结果表明，平均回收率在97.77%～99.75%，相对标准偏差（RSD）在0.4%～7.3%，定量结果准确，精密度好，测定结果能够满足实验室对批量化水产品硝基呋喃代谢物残留的检测要求。
关键词：水产品;硝基呋喃类代谢物;超高压液相色谱-串联质谱
自从1944年M.C.Dodd和W.B.Stillman发现5-硝基呋喃衍生物有抑菌作用后[1]，大量的硝基呋喃类药物被合成并广泛运用于医学和畜禽水产养殖等领域。因为其价格低且效果好，曾在水产养殖中广泛用于预防和治疗由革兰氏细菌引起的水产动物胃肠道疾病[2]。但研究表明，硝基呋喃类药物具有严重的致癌、致畸胎等毒副作用[3]。我国农业部于2002年12月24日发布的第235号公告及2005年10月28日发布的第560号公告中，硝基呋喃类药物被列为饲养过程中的禁用药物，在动物性食品中不得检出[4]。目前，全球大多数国家已将其列为禁用药物，水产品中硝基呋喃类药物的检测方法也很多，但因液相色谱-串联质谱法能够充分发挥超高效液相色谱的高分离度、高速以及串联质谱的高特异性和高灵敏度的作用，在水产品检测硝基呋喃时尤为常用[5]。本试验采用内标法定量，回收率较高且结果稳定，适用于实验室批量处理水产品硝基呋喃类代谢物的检测。
1 材料与方法
1.1 仪器与设备
三重四级杆液相色谱质谱联用仪API 4000+（AB SCIEX 公司）;超高效液相色谱仪LC-30A（日本岛津公司）;pH计（美国奥豪斯上海公司）;空气摇床（上海喆图科学仪器）;电子天平（上海舜宇科学仪器有限公司）。
1.2 材料与试剂
AHD标准品（德国WITEGA实验室，100 μg/mL）;SEM标准品（德国WITEGA实验室，100 μg/mL）;AOZ标准品（德国WITEGA实验室，100 μg/mL）;AMOZ标准品（德国WITEGA实验室，100 μg/mL）;AHD-13C3标准品（曼哈格，99.5%）;SCA-HCl-13C，15N2标准品（曼哈格，98.7%）;AOZ-D4标准品（曼哈格，98.7%）;AMOZ-D5标准品（曼哈格，99.5%）;二硝基苯甲醛（东京化成工业株式会社）;二甲亚砜（东京化成工业株式会社）;乙酸乙酯（霍尼韦尔）;正己烷（霍尼韦尔）;磷酸氢二钾（分析纯）;盐酸（分析纯）。
1.3 试验方法
1.3.1 标准溶液的配置
准确称取4种硝基呋喃代谢物标准品用甲醇配置成1 mg/mL的AMOZ、AOZ、SEM、AHD标准储备液。使用前准确吸取4种标准储备溶液，用水逐级稀释成100 ng/mL和10 ng/mL的混合溶液，4 ℃冷藏保存。
1.3.2 样品的处理
称取2.0 g阴性草鱼肉样品置于50 mL离心管中，再加入50 μL混合内标溶液（100 ng/mL）、10 mL盐酸（0.2 mol/L）、300 μL的2-硝基苯甲醛溶液（0.05 mol/L），涡旋混匀1 min，置于避光、37 ℃空气摇床中衍生16 h。取出样品，加入约5 mL磷酸氢二钾，调节pH值7.0～7.5，加入10 mL乙酸乙酯，涡旋振荡提取5 min，9 000 r/min离心5 min，提取全部上清液置于无刻度试管中，再加入10 mL乙酸乙酯重复一遍，合并上清液于40 ℃下氮气吹干。往吹干的试管中加入1.0 mL的0.1%甲酸水溶液+乙腈（9∶1），涡旋溶解，加入3 mL乙腈饱和的正己烷两次液液分配，去除脂肪，下层水相过0.22 μm滤膜后装瓶。另取阴性草鱼肉样，分别加入硝基呋喃类标准品，使添加浓度分别为0.5 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、4.0 μg/L、8.0 μg/L和12.0 μg/L，每个浓度做6个平行，进行回收率试验。
1.3.3 高效液相色谱-串联质谱条件
岛津C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，3 μm），柱温40 ℃，进样量10 μL，流速0.2 mL/min。流动相梯度洗脱条件见表1。质谱条件为电喷雾离子源（ESI），采用正离子扫描，检测方式为多反应监测，相关参数见表2。
2 结果与分析
2.1 硝基呋喃代谢物的标准曲线和检测方法的灵敏度
按上述条件测定系列质量浓度的4种硝基呋喃代谢物混合标准溶液，绘制标准工作曲线，硝基呋喃代谢物的线性方程和相关系数见表3。结果表明，4种硝基呋喃代谢物在0.5～12 ng/mL呈线性关系。
2.2 回收率和精密度试验
AMOZ、SEM、AHD及AOZ代谢物的回收率分别为84.4%～106.1%、92.5%～102.7%、93.9%～109.5%及93.1%～103.7%。相对标准偏差（RSD）在0.4%～7.3%。方法的回收率与精密度完全可以满足批量检测出具报告的要求，试验结果见表4.
3.结论
研究建立了测定水产品中硝基呋喃类代谢物的超高效液相色谱-串联质谱分析方法，相对回收率为97.8%～99.8%，相对标准偏差为0.4%～7.3%，检出限为0.25 μg/kg，定量限为0.5 μg/kg。运用经过优化后的方法得出的实验结果稳定、可靠，不仅能够提高样品处理效率，而且能够较好地解决阳性样品检测值偏低的问题。实验表明，本方法定量分析准确，精密度好，应用于实际样品的检测取得了满意结果，适合于快速检测水产品中硝基呋喃类代谢物。
参考文献
[1]ALI BH.Pharmacological，therapeutic and toxicological properties of furazolidone： some recent research[J].Veterinary Research Communications，1999，23（6）：343-360.
[2]徐偉，耿士伟，刘路，等.硝基呋喃类药物及其代谢物检测方法的研究进展[J].天津农业科学，2018，24（8）：16-20.
[3]NOUWS J F，LAURENSEN J.Postmortal degradation of furazolidone and furaltadone in edible tissues of calves[J].The Veterinary Quarterly，1990，12（1）：56-59.
[4]中华人民共和国农业部.中华人民共和国农业部公告第235号[Z].2002-12-24.
[5]高月明，冯笑军，李倩莹.超高效液相色谱-串联质谱法测定淡水鱼中硝基呋喃类代谢物残留[J].食品安全质量检测学报，2017，8（8）：3231-3236.
关键词：水产品;硝基呋喃类代谢物;超高压液相色谱-串联质谱
自从1944年M.C.Dodd和W.B.Stillman发现5-硝基呋喃衍生物有抑菌作用后[1]，大量的硝基呋喃类药物被合成并广泛运用于医学和畜禽水产养殖等领域。因为其价格低且效果好，曾在水产养殖中广泛用于预防和治疗由革兰氏细菌引起的水产动物胃肠道疾病[2]。但研究表明，硝基呋喃类药物具有严重的致癌、致畸胎等毒副作用[3]。我国农业部于2002年12月24日发布的第235号公告及2005年10月28日发布的第560号公告中，硝基呋喃类药物被列为饲养过程中的禁用药物，在动物性食品中不得检出[4]。目前，全球大多数国家已将其列为禁用药物，水产品中硝基呋喃类药物的检测方法也很多，但因液相色谱-串联质谱法能够充分发挥超高效液相色谱的高分离度、高速以及串联质谱的高特异性和高灵敏度的作用，在水产品检测硝基呋喃时尤为常用[5]。本试验采用内标法定量，回收率较高且结果稳定，适用于实验室批量处理水产品硝基呋喃类代谢物的检测。
1 材料与方法
1.1 仪器与设备
三重四级杆液相色谱质谱联用仪API 4000+（AB SCIEX 公司）;超高效液相色谱仪LC-30A（日本岛津公司）;pH计（美国奥豪斯上海公司）;空气摇床（上海喆图科学仪器）;电子天平（上海舜宇科学仪器有限公司）。
1.2 材料与试剂
AHD标准品（德国WITEGA实验室，100 μg/mL）;SEM标准品（德国WITEGA实验室，100 μg/mL）;AOZ标准品（德国WITEGA实验室，100 μg/mL）;AMOZ标准品（德国WITEGA实验室，100 μg/mL）;AHD-13C3标准品（曼哈格，99.5%）;SCA-HCl-13C，15N2标准品（曼哈格，98.7%）;AOZ-D4标准品（曼哈格，98.7%）;AMOZ-D5标准品（曼哈格，99.5%）;二硝基苯甲醛（东京化成工业株式会社）;二甲亚砜（东京化成工业株式会社）;乙酸乙酯（霍尼韦尔）;正己烷（霍尼韦尔）;磷酸氢二钾（分析纯）;盐酸（分析纯）。
1.3 试验方法
1.3.1 标准溶液的配置
准确称取4种硝基呋喃代谢物标准品用甲醇配置成1 mg/mL的AMOZ、AOZ、SEM、AHD标准储备液。使用前准确吸取4种标准储备溶液，用水逐级稀释成100 ng/mL和10 ng/mL的混合溶液，4 ℃冷藏保存。
1.3.2 样品的处理
称取2.0 g阴性草鱼肉样品置于50 mL离心管中，再加入50 μL混合内标溶液（100 ng/mL）、10 mL盐酸（0.2 mol/L）、300 μL的2-硝基苯甲醛溶液（0.05 mol/L），涡旋混匀1 min，置于避光、37 ℃空气摇床中衍生16 h。取出样品，加入约5 mL磷酸氢二钾，调节pH值7.0～7.5，加入10 mL乙酸乙酯，涡旋振荡提取5 min，9 000 r/min离心5 min，提取全部上清液置于无刻度试管中，再加入10 mL乙酸乙酯重复一遍，合并上清液于40 ℃下氮气吹干。往吹干的试管中加入1.0 mL的0.1%甲酸水溶液+乙腈（9∶1），涡旋溶解，加入3 mL乙腈饱和的正己烷两次液液分配，去除脂肪，下层水相过0.22 μm滤膜后装瓶。另取阴性草鱼肉样，分别加入硝基呋喃类标准品，使添加浓度分别为0.5 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、4.0 μg/L、8.0 μg/L和12.0 μg/L，每个浓度做6个平行，进行回收率试验。
1.3.3 高效液相色谱-串联质谱条件
岛津C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，3 μm），柱温40 ℃，进样量10 μL，流速0.2 mL/min。流动相梯度洗脱条件见表1。质谱条件为电喷雾离子源（ESI），采用正离子扫描，检测方式为多反应监测，相关参数见表2。
2 结果与分析
2.1 硝基呋喃代谢物的标准曲线和检测方法的灵敏度
按上述条件测定系列质量浓度的4种硝基呋喃代谢物混合标准溶液，绘制标准工作曲线，硝基呋喃代谢物的线性方程和相关系数见表3。结果表明，4种硝基呋喃代谢物在0.5～12 ng/mL呈线性关系。
2.2 回收率和精密度试验
AMOZ、SEM、AHD及AOZ代谢物的回收率分别为84.4%～106.1%、92.5%～102.7%、93.9%～109.5%及93.1%～103.7%。相对标准偏差（RSD）在0.4%～7.3%。方法的回收率与精密度完全可以满足批量检测出具报告的要求，试验结果见表4.
3.结论
研究建立了测定水产品中硝基呋喃类代谢物的超高效液相色谱-串联质谱分析方法，相对回收率为97.8%～99.8%，相对标准偏差为0.4%～7.3%，检出限为0.25 μg/kg，定量限为0.5 μg/kg。运用经过优化后的方法得出的实验结果稳定、可靠，不仅能够提高样品处理效率，而且能够较好地解决阳性样品检测值偏低的问题。实验表明，本方法定量分析准确，精密度好，应用于实际样品的检测取得了满意结果，适合于快速检测水产品中硝基呋喃类代谢物。
参考文献
[1]ALI BH.Pharmacological，therapeutic and toxicological properties of furazolidone： some recent research[J].Veterinary Research Communications，1999，23（6）：343-360.
[2]徐偉，耿士伟，刘路，等.硝基呋喃类药物及其代谢物检测方法的研究进展[J].天津农业科学，2018，24（8）：16-20.
[3]NOUWS J F，LAURENSEN J.Postmortal degradation of furazolidone and furaltadone in edible tissues of calves[J].The Veterinary Quarterly，1990，12（1）：56-59.
[4]中华人民共和国农业部.中华人民共和国农业部公告第235号[Z].2002-12-24.
[5]高月明，冯笑军，李倩莹.超高效液相色谱-串联质谱法测定淡水鱼中硝基呋喃类代谢物残留[J].食品安全质量检测学报，2017，8（8）：3231-3236.