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【内容摘要】通过印迹聚合物制备大孔树脂柱色谱对黄芪提取液的选择性吸附与分离实验，并利用38%、41%、43%乙醇梯度洗脱，并且采用高效液相色谱法检测黄酮有效成分浓度，实验表面该分子印迹聚合物对黄芪提取液中刺芒柄花素具有很好的选择识别能力。
【关键词】黄芪 化学实验 聚合程度分析 结果与分析
一、实验试剂
（1）刺芒柄花素：分析纯；
（2）甲基丙烯酸（MAA）：分析纯，天津市大茂化学试剂厂；
（3）偶氮二异丁腈（AIBN）：分析纯，天津市大茂化学试剂厂；
（4）乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）：分析纯；
（5）无水乙醇：分析纯，上海市国药集团化学试剂有限公司；
（6）95%乙醇：分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；
（7）色谱甲醇：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；
（8）黄芪饮片，河北康派中药材有限公司
二、实验仪器
Agilent 1200型高效液相色谱仪，美国安捷伦有限公司；
UV1600型紫外可见分光光度计，北京瑞利分析仪器厂；
WQF-310傅立叶变换红外光谱仪，北京第二光学仪器厂；
DHG-924385-Ⅲ型电热恒温鼓风干燥箱，上海市新苗医疗器械制造有限公司；
SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；
84-1磁力搅拌控温电热套，山东省鄄城新科教学仪器厂；
HH-4数显恒温水浴锅，上海浦东物理光学仪器厂；
RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；
SB25-12DT型高频数控超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司；
FB223自动内校电子分析天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；
FW-4A型压片机，天津光学仪器厂；
索式提取器
全自动比表面积和孔径分析仪，美国康塔公司Quadrasorb SI
三、实验方法
1.印迹聚合物的制备
称取0.268 g（1 mmol）刺芒柄花素溶于7 mL无水乙醇中，加入0.68 mL（8 mmol）甲基丙烯酸（MAA），搅拌三小时后，加入3.77 mL（20 mmol）乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）和60 mg 偶氮二异丁腈（AIBN），超声活化10 min，再通N2脱氧5 min，抽真空密封后放入恒温水浴锅中，60℃下反应至无溶剂生成聚合物。然后将聚合物置于烘箱中60℃干燥，干燥后研磨称重，用95%乙醇洗涤模板分子和未聚合的功能单体和交联剂，洗脱后置于烘箱60℃下干燥，得到以MAA为功能单体的刺芒柄花素分子印迹聚合物F-MIPs。同时做空白实验。
2.紫外吸收光谱测定萃取过程
每隔三小时取溶液进行紫外吸收光谱分析，直到最终乙醇中刺芒柄花素含量不再变化为止。
3.黄芪提取液的制备
称取90 g黄芪饮片，用粉碎机研成粉末，用720 mL70%乙醇溶液浸泡半小时后，在一定温度下（90℃）回流2 h，过滤，收集滤液。滤渣用540 mL70%乙醇溶液水浴浸取1 h后，过滤，收集滤液，合并两次滤液，减压回收乙醇，加520 mL水，超声溶解，过滤，得黄芪提取液。
4.印迹聚合物对黄芪提取液的选择性吸附与分离
将黄芪提取液通过聚合物柱色谱方法进行选择性吸附与分离。即用150 mL黄芪提取液以1 mL/min的速度通过印迹聚合物（F-MIPs）色谱柱，上样后以200 mL水洗脱后，再用适当洗脱剂（梯度浓度的乙醇溶液）洗涤并收集洗脱产物。洗脱完毕后分别取50 mL洗脱液浓缩至干再溶于甲醇中，定容至10 mL容量瓶，用于高效液相色谱分析，其中高效液相色谱条件：色谱柱为Vp-ODS柱（250 mm ×4.6mm id，5 um）；流动相为甲醇-水梯度洗脱，甲醇梯度为：0-10 min，1-25%，10-20 min，25-50%，20-30 min，50-70%，30-50 min，70-90%，50-60 min，90-100%；流速为1.0 mL/min；柱温为35℃；检测波长为280 nm；进样量20 μL。
5.红外光谱分析
将制备的聚合物萃取前、聚合物萃取后和空白组聚合物及模板分子（刺芒柄花素）进行红外光谱测定，分析其结构，评价其是否聚合及聚合程度。
6.比表面分析
用比表面分析仪测定分子印迹化合物的比表面积以及它的孔径分布大小。
四、结果与分析
1.聚合程度分析
刺芒柄花素、聚合物萃取前、聚合物萃取后和空白组聚合物的萃取前和萃取后MAA为功能单体的刺芒柄花素聚合物与以MAA为功能单体的空白聚合物相比，以MAA为功能单体的空白聚合物在1440 cm-1左右没有吸收峰，这就说明1440 cm-1左右的吸收峰的确是印迹分子刺芒柄花素的吸收峰而不是功能单体、交联剂等物质的吸收峰。因此也就说明以MAA为功能单体的刺芒柄花素聚合物的确包裹了大量的刺芒柄花素。以MAA为功能单体的刺芒柄花素聚合物和萃取后的以MAA为功能单体的刺芒柄花素聚合物相比，萃取后的以MAA为功能单体的刺芒柄花素聚合物没有了1440 cm-1左右的吸收峰，说明此时刺芒柄花素已经被大部分萃取出来。得到了刺芒柄花素的印迹分子化合物。
2.印迹聚合物吸附分离黄芪提取液实验结果与分析
用150 mL黄芪提取液以1 mL/min 的速度通过印迹聚合物色谱柱，上样后以200 mL水洗脱后，再以38%乙醇溶液、41%乙醇溶液、43%乙醇溶液各200 mL进行梯度洗脱。洗脱完毕后分别依次取50 mL洗脱液浓缩至干再溶于甲醇中，定容至10 mL容量瓶，进行高效液相分析。黄芪中异黄酮类物质，其中化合物4即为目标物质刺芒柄花素，3为毛蕊异黄酮，其在结构上只与刺芒柄花素相差一个-OH。样液中刺芒柄花素的含量相对于1、2号物质峰面积较小，与3号物质（即毛蕊异黄酮）峰面积接近。
分子印迹化合物的孔径主要集中分布在0-10nm之间，属于纳米材料范畴。材料的吸附等温线属于类型IV等温线，说明刺芒柄花素分子印迹聚合物含均一分布的中孔，在一定的相对压力范围吸附质在中孔内的毛细管凝聚呈现饱和，对模板分子具有较好的吸附性。此外，仪器检测出材料的比表面积为3.645 m3/g。
五、结论
1.在最佳条件下，即模板分子、功能单体、交联剂物质量比例为1：8：20 mmol时，通过红外光谱表征，制得刺芒柄花素分子印迹聚合物。
2.通过比表面吸附与脱附实验，得知其具有均一分布的孔隙，其孔径主要集中在0-10nm之间。
3.通过印迹聚合物制备大孔树脂柱色谱对黄芪提取液的选择性吸附与分离实验，并利用38%、41%、43%乙醇梯度洗脱，并且采用高效液相色谱法检测黄酮有效成分浓度，实验表面该分子印迹聚合物对黄芪提取液中刺芒柄花素具有很好的选择识别能力。
4.此外在41%的乙醇浓度下开始洗涤目标产物刺芒柄花素效果最佳。
（作者单位：江西省赣州市龙南中学）
【关键词】黄芪 化学实验 聚合程度分析 结果与分析
一、实验试剂
（1）刺芒柄花素：分析纯；
（2）甲基丙烯酸（MAA）：分析纯，天津市大茂化学试剂厂；
（3）偶氮二异丁腈（AIBN）：分析纯，天津市大茂化学试剂厂；
（4）乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）：分析纯；
（5）无水乙醇：分析纯，上海市国药集团化学试剂有限公司；
（6）95%乙醇：分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；
（7）色谱甲醇：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；
（8）黄芪饮片，河北康派中药材有限公司
二、实验仪器
Agilent 1200型高效液相色谱仪，美国安捷伦有限公司；
UV1600型紫外可见分光光度计，北京瑞利分析仪器厂；
WQF-310傅立叶变换红外光谱仪，北京第二光学仪器厂；
DHG-924385-Ⅲ型电热恒温鼓风干燥箱，上海市新苗医疗器械制造有限公司；
SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；
84-1磁力搅拌控温电热套，山东省鄄城新科教学仪器厂；
HH-4数显恒温水浴锅，上海浦东物理光学仪器厂；
RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；
SB25-12DT型高频数控超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司；
FB223自动内校电子分析天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；
FW-4A型压片机，天津光学仪器厂；
索式提取器
全自动比表面积和孔径分析仪，美国康塔公司Quadrasorb SI
三、实验方法
1.印迹聚合物的制备
称取0.268 g（1 mmol）刺芒柄花素溶于7 mL无水乙醇中，加入0.68 mL（8 mmol）甲基丙烯酸（MAA），搅拌三小时后，加入3.77 mL（20 mmol）乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）和60 mg 偶氮二异丁腈（AIBN），超声活化10 min，再通N2脱氧5 min，抽真空密封后放入恒温水浴锅中，60℃下反应至无溶剂生成聚合物。然后将聚合物置于烘箱中60℃干燥，干燥后研磨称重，用95%乙醇洗涤模板分子和未聚合的功能单体和交联剂，洗脱后置于烘箱60℃下干燥，得到以MAA为功能单体的刺芒柄花素分子印迹聚合物F-MIPs。同时做空白实验。
2.紫外吸收光谱测定萃取过程
每隔三小时取溶液进行紫外吸收光谱分析，直到最终乙醇中刺芒柄花素含量不再变化为止。
3.黄芪提取液的制备
称取90 g黄芪饮片，用粉碎机研成粉末，用720 mL70%乙醇溶液浸泡半小时后，在一定温度下（90℃）回流2 h，过滤，收集滤液。滤渣用540 mL70%乙醇溶液水浴浸取1 h后，过滤，收集滤液，合并两次滤液，减压回收乙醇，加520 mL水，超声溶解，过滤，得黄芪提取液。
4.印迹聚合物对黄芪提取液的选择性吸附与分离
将黄芪提取液通过聚合物柱色谱方法进行选择性吸附与分离。即用150 mL黄芪提取液以1 mL/min的速度通过印迹聚合物（F-MIPs）色谱柱，上样后以200 mL水洗脱后，再用适当洗脱剂（梯度浓度的乙醇溶液）洗涤并收集洗脱产物。洗脱完毕后分别取50 mL洗脱液浓缩至干再溶于甲醇中，定容至10 mL容量瓶，用于高效液相色谱分析，其中高效液相色谱条件：色谱柱为Vp-ODS柱（250 mm ×4.6mm id，5 um）；流动相为甲醇-水梯度洗脱，甲醇梯度为：0-10 min，1-25%，10-20 min，25-50%，20-30 min，50-70%，30-50 min，70-90%，50-60 min，90-100%；流速为1.0 mL/min；柱温为35℃；检测波长为280 nm；进样量20 μL。
5.红外光谱分析
将制备的聚合物萃取前、聚合物萃取后和空白组聚合物及模板分子（刺芒柄花素）进行红外光谱测定，分析其结构，评价其是否聚合及聚合程度。
6.比表面分析
用比表面分析仪测定分子印迹化合物的比表面积以及它的孔径分布大小。
四、结果与分析
1.聚合程度分析
刺芒柄花素、聚合物萃取前、聚合物萃取后和空白组聚合物的萃取前和萃取后MAA为功能单体的刺芒柄花素聚合物与以MAA为功能单体的空白聚合物相比，以MAA为功能单体的空白聚合物在1440 cm-1左右没有吸收峰，这就说明1440 cm-1左右的吸收峰的确是印迹分子刺芒柄花素的吸收峰而不是功能单体、交联剂等物质的吸收峰。因此也就说明以MAA为功能单体的刺芒柄花素聚合物的确包裹了大量的刺芒柄花素。以MAA为功能单体的刺芒柄花素聚合物和萃取后的以MAA为功能单体的刺芒柄花素聚合物相比，萃取后的以MAA为功能单体的刺芒柄花素聚合物没有了1440 cm-1左右的吸收峰，说明此时刺芒柄花素已经被大部分萃取出来。得到了刺芒柄花素的印迹分子化合物。
2.印迹聚合物吸附分离黄芪提取液实验结果与分析
用150 mL黄芪提取液以1 mL/min 的速度通过印迹聚合物色谱柱，上样后以200 mL水洗脱后，再以38%乙醇溶液、41%乙醇溶液、43%乙醇溶液各200 mL进行梯度洗脱。洗脱完毕后分别依次取50 mL洗脱液浓缩至干再溶于甲醇中，定容至10 mL容量瓶，进行高效液相分析。黄芪中异黄酮类物质，其中化合物4即为目标物质刺芒柄花素，3为毛蕊异黄酮，其在结构上只与刺芒柄花素相差一个-OH。样液中刺芒柄花素的含量相对于1、2号物质峰面积较小，与3号物质（即毛蕊异黄酮）峰面积接近。
分子印迹化合物的孔径主要集中分布在0-10nm之间，属于纳米材料范畴。材料的吸附等温线属于类型IV等温线，说明刺芒柄花素分子印迹聚合物含均一分布的中孔，在一定的相对压力范围吸附质在中孔内的毛细管凝聚呈现饱和，对模板分子具有较好的吸附性。此外，仪器检测出材料的比表面积为3.645 m3/g。
五、结论
1.在最佳条件下，即模板分子、功能单体、交联剂物质量比例为1：8：20 mmol时，通过红外光谱表征，制得刺芒柄花素分子印迹聚合物。
2.通过比表面吸附与脱附实验，得知其具有均一分布的孔隙，其孔径主要集中在0-10nm之间。
3.通过印迹聚合物制备大孔树脂柱色谱对黄芪提取液的选择性吸附与分离实验，并利用38%、41%、43%乙醇梯度洗脱，并且采用高效液相色谱法检测黄酮有效成分浓度，实验表面该分子印迹聚合物对黄芪提取液中刺芒柄花素具有很好的选择识别能力。
4.此外在41%的乙醇浓度下开始洗涤目标产物刺芒柄花素效果最佳。
（作者单位：江西省赣州市龙南中学）