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【摘要】目的：探讨免疫组织化学中不同抗原修复方式对染色结果的影响。方法：采用高温高压修复法、微波修复法和酶消化法对病理科采用的四项免疫组织化学标记（p53、Ki67、C-erbB-2、cyclin D1）进行染色，在显微镜下对染色阳性率进行比较。结果p53、Ki67、C-erbB-2、cyclin D1四项标记在三种修复方法下均具有较高的阳性率。高温高压修复法、微波修复法的染色结果阳性率较高，与酶消化法相比，有统计学意义（P<0.05）。结论：三种修复方法均有实用性，三者相比，高温高压修复法、微波修复法修复效果更好，对病理诊断指导意义较大。
【关键词】免疫组化；抗原修复；方法对比
中图分类号：B3 文献标识码：A 文章编号：2096-5249（2018）01-035-01
免疫组化技术是病理科常见鉴别技术，在病理诊断中发挥显著作用。石蜡切片由于在制作过程中使用大量有机溶剂（酒精、二甲苯）和包埋过程中加热处理使抗原活性丧失，所以通常采用抗原修复方法来提高石蜡切片免疫组化反应的敏感性。抗原修复的质量在一定程度上决定了染色结果的好坏，从而影响诊断结果的判定[1]。目前，抗原修复的方法有酶修复法、高温高压修复法、微波修复法等。本科室采用不同抗原修复法对p53、Ki67、C-erbB-2、cyclin D1进行比较获取最佳抗原修复方法。
1 材料
1.1 材料：选用新疆医科大学第二附属医院病理科2010年3月-2016年6月期间手术切除的经病理证实为食管鳞癌的石蜡包埋组织共150例。经两位病理医师诊断确诊，组织直径在3cm以上，苏木精-伊红染色法（HE）染色切片细胞清晰，对比度明显、颜色鲜艳。
1.2 主要试剂：即用型p53、Ki67、C-erbB-2、cyclin D1一抗，二抗，DAB试剂，高压锅、微波炉。
2 方法
2.1 染色方法：组织经4%甲醛固定，常规石蜡包埋，3～5μm连续切片，60℃烤箱烤片过夜备用。抗原修复法分三组：①将切片置于盛有柠檬酸盐缓冲液的高压锅内高压修复3min；②用柠檬酸盐缓冲液微波加热10min；③或用胰酶或胃酶消化15min。免疫组化染色步骤均按照实验操作步骤完成。
2.2 染色结果判定：p53、Ki67、cyclin D1的表达均定位于细胞核，C-erbB-2的表达定位于细胞膜，以细胞的胞质和（或）胞核出现黄色或棕黄色颗粒为阳性染色，按着色强度及阳性细胞比例评分，着色强度按无染色、浅黄色、黄色、棕黄色分别计为0、1、2、3分；按阳性细胞比例，<5%计0分，5%-25%计1分，25%-50%计2分，50%-75%计3分，>75%计4分。两分值相加，≤3判为阴性（-），>4判为阳性（+）。；经至少两位有经验的病理科医生盲法观察。
2.3 统计学处理：应用SPSS13.0统计软件对数据进行分析处理：数据结果分别采用χ2检验，检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
三种方法下四项标记阳性率比较
四项标记在三种抗原修复方法下阳性率均>50%，Ki67标记阳性率最高，达到85%以上。p53、Ki67、cyclin D1的阳性率比较结果中，高温高压法与微波法无差异，阳性率均高于酶消化法，结果具有统计学意义（P<0.05）。C-erbB-2的阳性率比较结果无统计学意义（P>0.05），但前两种方法阳性率高于酶消化法（表1）。
4 讨论
免疫组化的技术步骤繁多，从标本固定到组织包埋、切片、烤片，再到抗原修复，实验室操作条件以及操作人员的技术素质都会影响染色结果[2]。有时会因为不同地区温度、湿度以及水质差异而影响染色结果，产生假阴性，造成病理诊断误判，从而影响临床误诊漏诊。抗原修复方式是影响免疫组化染色结果的最主要因素之一[3]。
免疫组化常见的七钟氛修复方法中，高温高压抗原修复法与微波抗原修复法的原理大致相同，通过高温高压作用或高频电磁波使缓冲液中离子或极性分子高速运动产生碰撞，使醛-氨基、抗原与其他分子间的交联或由蛋白质结构因水解而断裂，暴露出被掩盖的抗原决定簇[4]。酶消化法是通过溶解洗脱变性蛋白而达到抗原修复作用。
本研究提示，在相同条件下，高温高压抗原修复法与微波抗原修复法的修复结果阳性率较高，而酶消化法阳性率较前两种修复方法低，结果有统计学意义。不同定位的抗原在不同修复方法下修复效果不同，定位于细胞核的抗原用高溫高压修复法阳性率较高，而定位于细胞膜的抗原用微波加热法阳性率较高，其中定位于细胞核的抗原酶消化法阳性率低于前两种方法，结果有统计学意义。
病理诊断是疾病诊断的金指标，而免疫组化染色结果是病理诊断的重要组成部分，控制免疫组化染色结果的质量十分重要，针对不同类型抗原，选择适合的方法，提高染色阳性率及强度，为病理诊断提供依据。
参考文献：
[1]刘鲜艳，郝斌威，马爱玲，等.不同抗原修复方法对层粘连蛋白免疫组化染色结果的影响[J].临床与实验病理学杂志，2015（2）：216-217.
[2]鞠学萍.免疫组化染色的操作技巧和注意事项[J].中国继续医学教育，2015（18）：48-49.
[3]姚梅宏，郑智勇.免疫组化抗原修复技术新进展[J].临床与实验病理学杂志，2013，29（5）：544-547.
[4]黄建平，杨映红，吴雪晶.不同抗原修复法对免疫组化HBcAg染色结果的影响[J].临床与实验病理学杂志，2017，33（5）：577-578.
【关键词】免疫组化；抗原修复；方法对比
中图分类号：B3 文献标识码：A 文章编号：2096-5249（2018）01-035-01
免疫组化技术是病理科常见鉴别技术，在病理诊断中发挥显著作用。石蜡切片由于在制作过程中使用大量有机溶剂（酒精、二甲苯）和包埋过程中加热处理使抗原活性丧失，所以通常采用抗原修复方法来提高石蜡切片免疫组化反应的敏感性。抗原修复的质量在一定程度上决定了染色结果的好坏，从而影响诊断结果的判定[1]。目前，抗原修复的方法有酶修复法、高温高压修复法、微波修复法等。本科室采用不同抗原修复法对p53、Ki67、C-erbB-2、cyclin D1进行比较获取最佳抗原修复方法。
1 材料
1.1 材料：选用新疆医科大学第二附属医院病理科2010年3月-2016年6月期间手术切除的经病理证实为食管鳞癌的石蜡包埋组织共150例。经两位病理医师诊断确诊，组织直径在3cm以上，苏木精-伊红染色法（HE）染色切片细胞清晰，对比度明显、颜色鲜艳。
1.2 主要试剂：即用型p53、Ki67、C-erbB-2、cyclin D1一抗，二抗，DAB试剂，高压锅、微波炉。
2 方法
2.1 染色方法：组织经4%甲醛固定，常规石蜡包埋，3～5μm连续切片，60℃烤箱烤片过夜备用。抗原修复法分三组：①将切片置于盛有柠檬酸盐缓冲液的高压锅内高压修复3min；②用柠檬酸盐缓冲液微波加热10min；③或用胰酶或胃酶消化15min。免疫组化染色步骤均按照实验操作步骤完成。
2.2 染色结果判定：p53、Ki67、cyclin D1的表达均定位于细胞核，C-erbB-2的表达定位于细胞膜，以细胞的胞质和（或）胞核出现黄色或棕黄色颗粒为阳性染色，按着色强度及阳性细胞比例评分，着色强度按无染色、浅黄色、黄色、棕黄色分别计为0、1、2、3分；按阳性细胞比例，<5%计0分，5%-25%计1分，25%-50%计2分，50%-75%计3分，>75%计4分。两分值相加，≤3判为阴性（-），>4判为阳性（+）。；经至少两位有经验的病理科医生盲法观察。
2.3 统计学处理：应用SPSS13.0统计软件对数据进行分析处理：数据结果分别采用χ2检验，检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
三种方法下四项标记阳性率比较
四项标记在三种抗原修复方法下阳性率均>50%，Ki67标记阳性率最高，达到85%以上。p53、Ki67、cyclin D1的阳性率比较结果中，高温高压法与微波法无差异，阳性率均高于酶消化法，结果具有统计学意义（P<0.05）。C-erbB-2的阳性率比较结果无统计学意义（P>0.05），但前两种方法阳性率高于酶消化法（表1）。
4 讨论
免疫组化的技术步骤繁多，从标本固定到组织包埋、切片、烤片，再到抗原修复，实验室操作条件以及操作人员的技术素质都会影响染色结果[2]。有时会因为不同地区温度、湿度以及水质差异而影响染色结果，产生假阴性，造成病理诊断误判，从而影响临床误诊漏诊。抗原修复方式是影响免疫组化染色结果的最主要因素之一[3]。
免疫组化常见的七钟氛修复方法中，高温高压抗原修复法与微波抗原修复法的原理大致相同，通过高温高压作用或高频电磁波使缓冲液中离子或极性分子高速运动产生碰撞，使醛-氨基、抗原与其他分子间的交联或由蛋白质结构因水解而断裂，暴露出被掩盖的抗原决定簇[4]。酶消化法是通过溶解洗脱变性蛋白而达到抗原修复作用。
本研究提示，在相同条件下，高温高压抗原修复法与微波抗原修复法的修复结果阳性率较高，而酶消化法阳性率较前两种修复方法低，结果有统计学意义。不同定位的抗原在不同修复方法下修复效果不同，定位于细胞核的抗原用高溫高压修复法阳性率较高，而定位于细胞膜的抗原用微波加热法阳性率较高，其中定位于细胞核的抗原酶消化法阳性率低于前两种方法，结果有统计学意义。
病理诊断是疾病诊断的金指标，而免疫组化染色结果是病理诊断的重要组成部分，控制免疫组化染色结果的质量十分重要，针对不同类型抗原，选择适合的方法，提高染色阳性率及强度，为病理诊断提供依据。
参考文献：
[1]刘鲜艳，郝斌威，马爱玲，等.不同抗原修复方法对层粘连蛋白免疫组化染色结果的影响[J].临床与实验病理学杂志，2015（2）：216-217.
[2]鞠学萍.免疫组化染色的操作技巧和注意事项[J].中国继续医学教育，2015（18）：48-49.
[3]姚梅宏，郑智勇.免疫组化抗原修复技术新进展[J].临床与实验病理学杂志，2013，29（5）：544-547.
[4]黄建平，杨映红，吴雪晶.不同抗原修复法对免疫组化HBcAg染色结果的影响[J].临床与实验病理学杂志，2017，33（5）：577-578.