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【摘要】 目的：研究南昌地区5岁以下婴幼儿轮状病毒肠炎G血清型的流行病学。方法：对2007年1月-2009年12月在江西省儿童医院就诊的5岁以下腹泻患儿进行抽样调查，收集腹泻患儿粪便标本检测轮状病毒，并对轮状病毒阳性标本用逆转录PCR进行G血清型的分型研究。结果：共检测标本286份，其中轮状病毒阳性标本132份，检出率为46.1%；血清分型发现，轮状病毒肠炎G分型以G1 （41.9% ）和G3（28.9% ）为主要流行株，未分型病毒株占22.3%。结论：提示南昌地区婴幼儿轮状病毒肠炎的病原体以G1型和G3型轮状病毒最多见， G1型和G3型可作为南昌地区轮状病毒疫苗研制的主要血清型。
【关键词】 轮状病毒腹泻；婴幼儿轮状病毒肠炎流行病学；分子 G血清型
人轮状病毒（HRV）是临床中比较常见的一种病毒，是诱发婴幼儿腹泻的一种重要病毒，而且多在5岁以下的儿童中比较常见。通过数据的调查显示，绝大部分的病毒流行于在发展中的国家[1]。而在我国因人轮状病毒而引起的腹泻有40.0%，因此，这种病毒引起的腹泻所在的比重还是相当大。目前，临床上对于该病的治疗还无较好的药物，其中，人们认为轮状病毒疫苗是控制轮状病毒感染的一个重要举措。通过国内外的相关性研究[2，3，4]表明，不同的地区的病毒株均具有较大的不同，因此，这为临床中研制轮状病毒疫苗也具有较大的差异性。本文对南昌市的轮状病毒G型与其相关的临床特征进行深入的探讨，其目的是为本病的治疗与预防提高有力的参考资料，同时，为该地区研制具有针对性强的轮状病毒疫苗提高一定的参考依据。
1材料与方法
1.1材料
本次研究从我院2007年1月到2009年12月之间进行随机的抽取5岁以下的腹泻患儿286例，同时对于其进行细菌培养和显微镜的检查，并有效的排除细菌性的肠炎患儿。本组男性患儿183例，女性患儿154例，患儿的年龄为3个月到60个月，平均年龄为（15.3±2.3）月。病程时间为2～13天，平均病程时间为（8.9±2.3）天，本组的所有患儿均未进行接种轮状病毒疫苗。
1.2方法
1.2.1DNA制备与检测
本次研究对于粪便RVRNA的提取和检测主要采用Trizol法，同时依据说明书进行操作，并提取粪便悬液中的核酸，然后采取聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行有效的检测[5]。本次研究中干燥标本采取pH=7.6的Tris液稀释1 mL/L进行稀释，并取上清液，同时，采取30μl的无菌水进行融解RNA备用。
1.2.2RT-PCR法扩增
将选取的RV的VP7全基因进行扩增，并采取 net-PCR法进行有效的对VP7基因型（G基因型）进行分型处理。第一次扩增：将编码VP7的基因两端保守的序列设计引物（主要包括Beg9和End9）进行RT-PCR扩增，长度为1062bp；第2次扩增：将苷酸序列高变区的设计型特异性引物（主要包括aAT8、aBT1和aCT2以及aDT4与aET3、aFT9等）和负链引物选择3′端保守的共同引物进行有效的扩增，扩增不同的长度来区别不同基因型[6]。本次研究所用的扩增引物如下表1所示：
1.2.3反应条件
本次研究选取的PCR反应池为2μL，取二甲基亚砜和上、下游的引物均2μL，并进行离心处理，离心率为1000 r/min，并取上层清液，然后采取温度为97℃进行变性，时间控制为5min，并立即进行冰浴处理，时间为5 min；向反应中加入5×RT-PCR的缓冲液和2. 5μL 的d NTP，以及5U/L的AMV反转录酶，并采取94℃的温度进行变性处理，时间为5min，最后加入10×PCR的缓冲液和DNA聚合酶以及dNTP，并加水到70μL。再次采取94℃的温度进行加热处理，时间控制为1min，并进行94℃、1min；42℃、2min；72℃、3 min；共30个循环，最后采取72℃的温度进行延伸，时间8min。并将扩增的产物采取10 g·L-1的琼脂糖凝胶电泳进行有效的观察。
2结果
通过本次的研究分析，286份标本共检出132份病毒，阳性率46.1%。通过分型，主要为G1型、G3型，具体的情况如下表2所示：
3讨论
通过资料显示，在我国主要流行轮状病毒为G1-G4型，而且在方肇寅等[7]人的资料显示，G1-G4型所占的比例为：67.1%、21.4%、9.4%、2.1%，其中， G1型是主要的流行菌株。而任莉娜等[8]分析，主要以G1型为主要的菌株。而徐锦等 [9]分析，主要以G3型菌株为主，其次才是G1型。而吴先华等报道[10]，在浙江省衢州市2008-2010年的资料显示，主要以G3型菌株为流行菌株。
通过本次的临床调查显示，在南昌地区主要以G3型菌株和G1型菌株为主，而且所在的比率分别为41.7%和27.3%，而且本次的研究与张丽杰等[11]的研究比较相近。另外，在我国的台湾等地区显示，除了显示有G1、G2以及G3型菌株之外，还显示有 G9型菌株 [12]。而在本次的研究分析， G9型轮状病毒只检测出有1株，而且资料显示G9型不是本地区的流行菌株另外，通过本次的研究分析，有19株病毒株未能够进行分型，其原因可能与本次研究的方法和G血清型等有关，需要临床的大型试验进一步的分析。
因此，在南昌地区的婴幼儿轮状病毒肠炎中，主要以G1型与G3型比较常见，同时，G1型和G3型能够作为该地区进行研制轮状病毒疫苗的重要参考依据。但是有仍部分的菌株未进行分型，需要进一步的临床监测。
参考文献
[1]van Doorn LJ，Kleter B，Hoefnagel E， etal .Detection and genotyping of human rotavirus VP4 and VP7 genes by reverse transcriptase PCR and reverse hybridization[J].Journal of Clinical Microbiology，2009，47（09）： 2704～2712. [2] Liao Hongyu， Zhang Mengyan， Chen Xikai， et al. Chengdu region of infantile diarrhea rotavirus genotyping study [J]. Journal of Sichuan University （ Medical Science Edition ）， 2011，24 （ 04）： 775～776.
[3] Wei Jingfen， ye Fufa . Infant diarrhea with rotavirus infection detection and analysis of [J]. maternal and child health care of China， 2009，22 （ 12）： 445～446.
[4]李方去，刘彩霞，蒋伟燕.4160例婴幼儿腹泻轮状病毒感染情况分析[J].医学研究杂志，2011，22（03） ：644～646.
[5]霍燕凤，金玉，方肇寅.酒泉地区婴幼儿腹泻的A组轮状病毒分子基因特征研究[J].中华妇幼临床医学杂志，2008，22（05）：776～778.
[6]林勇，李敏，马慧丽，等.巢式聚合酶链反应检测A组轮状病毒基因型的研究[J].检验医学，2007，12（04）：688～689.
[7]叶新华，金玉，方肇寅，等.2001～2007年兰州急性腹泻住院儿童轮状病毒感染的临床特点及分子流行病学研究[J].中国疫苗和免疫，2008，23（05）：612～613.
[8]任莉娜，张炳丽，梁英，等.哈尔滨地区引起婴幼儿腹泻轮状病毒的分子流行病学特征[J].中国卫生检验杂志，2009，31（03）：554～555.
[9]徐锦，孙家娥，丁韵珍，等.2001至2005年上海市1450份住院患儿A组轮状病毒分子流行病学研究[J].中国循证儿科杂志，2007，22（02）：766～768.
[10]吴先华，付方俊，汪勇军，等.腹泻患儿轮状病毒感染G_P基因型分析[J].中华医院感染学杂志，2011，21（02）：234～235.
[11]张丽杰，方安.中国婴幼儿轮状病毒腹泻的流行病学和疾病负担研究进展[J].中国计划免疫，2007，13（02）：186～191.
[12] Xu Jin， Ding Yunzhen， sun Jiae， such as .2001 to Shanghai city in 2005 1450 hospitalized patients of group A rotavirus molecular epidemiological study of [J]. Chinese Journal of Pediatrics， 2007，34 （ 02）： 900～902.
【关键词】 轮状病毒腹泻；婴幼儿轮状病毒肠炎流行病学；分子 G血清型
人轮状病毒（HRV）是临床中比较常见的一种病毒，是诱发婴幼儿腹泻的一种重要病毒，而且多在5岁以下的儿童中比较常见。通过数据的调查显示，绝大部分的病毒流行于在发展中的国家[1]。而在我国因人轮状病毒而引起的腹泻有40.0%，因此，这种病毒引起的腹泻所在的比重还是相当大。目前，临床上对于该病的治疗还无较好的药物，其中，人们认为轮状病毒疫苗是控制轮状病毒感染的一个重要举措。通过国内外的相关性研究[2，3，4]表明，不同的地区的病毒株均具有较大的不同，因此，这为临床中研制轮状病毒疫苗也具有较大的差异性。本文对南昌市的轮状病毒G型与其相关的临床特征进行深入的探讨，其目的是为本病的治疗与预防提高有力的参考资料，同时，为该地区研制具有针对性强的轮状病毒疫苗提高一定的参考依据。
1材料与方法
1.1材料
本次研究从我院2007年1月到2009年12月之间进行随机的抽取5岁以下的腹泻患儿286例，同时对于其进行细菌培养和显微镜的检查，并有效的排除细菌性的肠炎患儿。本组男性患儿183例，女性患儿154例，患儿的年龄为3个月到60个月，平均年龄为（15.3±2.3）月。病程时间为2～13天，平均病程时间为（8.9±2.3）天，本组的所有患儿均未进行接种轮状病毒疫苗。
1.2方法
1.2.1DNA制备与检测
本次研究对于粪便RVRNA的提取和检测主要采用Trizol法，同时依据说明书进行操作，并提取粪便悬液中的核酸，然后采取聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行有效的检测[5]。本次研究中干燥标本采取pH=7.6的Tris液稀释1 mL/L进行稀释，并取上清液，同时，采取30μl的无菌水进行融解RNA备用。
1.2.2RT-PCR法扩增
将选取的RV的VP7全基因进行扩增，并采取 net-PCR法进行有效的对VP7基因型（G基因型）进行分型处理。第一次扩增：将编码VP7的基因两端保守的序列设计引物（主要包括Beg9和End9）进行RT-PCR扩增，长度为1062bp；第2次扩增：将苷酸序列高变区的设计型特异性引物（主要包括aAT8、aBT1和aCT2以及aDT4与aET3、aFT9等）和负链引物选择3′端保守的共同引物进行有效的扩增，扩增不同的长度来区别不同基因型[6]。本次研究所用的扩增引物如下表1所示：
1.2.3反应条件
本次研究选取的PCR反应池为2μL，取二甲基亚砜和上、下游的引物均2μL，并进行离心处理，离心率为1000 r/min，并取上层清液，然后采取温度为97℃进行变性，时间控制为5min，并立即进行冰浴处理，时间为5 min；向反应中加入5×RT-PCR的缓冲液和2. 5μL 的d NTP，以及5U/L的AMV反转录酶，并采取94℃的温度进行变性处理，时间为5min，最后加入10×PCR的缓冲液和DNA聚合酶以及dNTP，并加水到70μL。再次采取94℃的温度进行加热处理，时间控制为1min，并进行94℃、1min；42℃、2min；72℃、3 min；共30个循环，最后采取72℃的温度进行延伸，时间8min。并将扩增的产物采取10 g·L-1的琼脂糖凝胶电泳进行有效的观察。
2结果
通过本次的研究分析，286份标本共检出132份病毒，阳性率46.1%。通过分型，主要为G1型、G3型，具体的情况如下表2所示：
3讨论
通过资料显示，在我国主要流行轮状病毒为G1-G4型，而且在方肇寅等[7]人的资料显示，G1-G4型所占的比例为：67.1%、21.4%、9.4%、2.1%，其中， G1型是主要的流行菌株。而任莉娜等[8]分析，主要以G1型为主要的菌株。而徐锦等 [9]分析，主要以G3型菌株为主，其次才是G1型。而吴先华等报道[10]，在浙江省衢州市2008-2010年的资料显示，主要以G3型菌株为流行菌株。
通过本次的临床调查显示，在南昌地区主要以G3型菌株和G1型菌株为主，而且所在的比率分别为41.7%和27.3%，而且本次的研究与张丽杰等[11]的研究比较相近。另外，在我国的台湾等地区显示，除了显示有G1、G2以及G3型菌株之外，还显示有 G9型菌株 [12]。而在本次的研究分析， G9型轮状病毒只检测出有1株，而且资料显示G9型不是本地区的流行菌株另外，通过本次的研究分析，有19株病毒株未能够进行分型，其原因可能与本次研究的方法和G血清型等有关，需要临床的大型试验进一步的分析。
因此，在南昌地区的婴幼儿轮状病毒肠炎中，主要以G1型与G3型比较常见，同时，G1型和G3型能够作为该地区进行研制轮状病毒疫苗的重要参考依据。但是有仍部分的菌株未进行分型，需要进一步的临床监测。
参考文献
[1]van Doorn LJ，Kleter B，Hoefnagel E， etal .Detection and genotyping of human rotavirus VP4 and VP7 genes by reverse transcriptase PCR and reverse hybridization[J].Journal of Clinical Microbiology，2009，47（09）： 2704～2712. [2] Liao Hongyu， Zhang Mengyan， Chen Xikai， et al. Chengdu region of infantile diarrhea rotavirus genotyping study [J]. Journal of Sichuan University （ Medical Science Edition ）， 2011，24 （ 04）： 775～776.
[3] Wei Jingfen， ye Fufa . Infant diarrhea with rotavirus infection detection and analysis of [J]. maternal and child health care of China， 2009，22 （ 12）： 445～446.
[4]李方去，刘彩霞，蒋伟燕.4160例婴幼儿腹泻轮状病毒感染情况分析[J].医学研究杂志，2011，22（03） ：644～646.
[5]霍燕凤，金玉，方肇寅.酒泉地区婴幼儿腹泻的A组轮状病毒分子基因特征研究[J].中华妇幼临床医学杂志，2008，22（05）：776～778.
[6]林勇，李敏，马慧丽，等.巢式聚合酶链反应检测A组轮状病毒基因型的研究[J].检验医学，2007，12（04）：688～689.
[7]叶新华，金玉，方肇寅，等.2001～2007年兰州急性腹泻住院儿童轮状病毒感染的临床特点及分子流行病学研究[J].中国疫苗和免疫，2008，23（05）：612～613.
[8]任莉娜，张炳丽，梁英，等.哈尔滨地区引起婴幼儿腹泻轮状病毒的分子流行病学特征[J].中国卫生检验杂志，2009，31（03）：554～555.
[9]徐锦，孙家娥，丁韵珍，等.2001至2005年上海市1450份住院患儿A组轮状病毒分子流行病学研究[J].中国循证儿科杂志，2007，22（02）：766～768.
[10]吴先华，付方俊，汪勇军，等.腹泻患儿轮状病毒感染G_P基因型分析[J].中华医院感染学杂志，2011，21（02）：234～235.
[11]张丽杰，方安.中国婴幼儿轮状病毒腹泻的流行病学和疾病负担研究进展[J].中国计划免疫，2007，13（02）：186～191.
[12] Xu Jin， Ding Yunzhen， sun Jiae， such as .2001 to Shanghai city in 2005 1450 hospitalized patients of group A rotavirus molecular epidemiological study of [J]. Chinese Journal of Pediatrics， 2007，34 （ 02）： 900～902.