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摘要[目的] 为了找到可以加速微藻富集的合适絮凝剂。[方法] 制备了壳聚糖的降解产物壳寡糖，用于绿色巴夫藻（Pavlovaviridis Tseng， Chen et Zhang）和小球藻（Chloreiia spp.） 絮凝富集。[结果] 终浓度为30 mg/L以上的壳寡糖溶液对2种藻类具有显著的促沉降效应。当壳寡糖与6 mg/L聚合氯化铝混合使用时，壳寡糖/聚合氯化铝促沉降效应明显提高。[结论] 壳寡糖可以用于微藻大规模生产的采收。
关键词壳寡糖； 聚合氯化铝；微藻；沉降
中图分类号S931.1文献标识码A文章编号0517-6611（2014）07-01905-02
基金项目江苏省“333工程”科研资助项目（BRA2012066）；江苏省高校科研成果产业化推进项目（JHB2011C71）；南通市农业科技创新与产业化项目（HL2012017）。
作者简介张跃群（1968-） ，女，江苏如皋人，教授，硕士，从事植物生理学的教学与科研工作。
收稿日期20140211水体中的微藻又称单细胞藻类，个体大小从几微米到几十微米。除了调节海洋和江河湖泊的碳、氧循环外，这一庞大的、种类繁多的微小植物组成的生态类群中一些种类还具有极其重要的营养价值[1]。因而，微藻被广泛用于水产经济动物的（开口）饵料以及人类的功能食品[2]，甚至被作为有潜力完全取代石油用于生产运输用燃料的生物质资源[3]。大规模生产微藻仍需解决采收的难题。传统过滤和离心法大大增加了生产成本和生产周期，因此采用合适的絮凝剂加速微藻的富集越来越受到人们的关注。
与无机盐如聚合氯化铝、三氯化铁以及黏土凝聚法相比，壳聚糖絮凝采收微藻具有用量少、效率高、无毒等特点[4]。然而，由于壳聚糖是高分子化合物，分子量通常在几十万至上百万，且分子结构紧密，不能溶于水，从而限制其应用。开发水溶性的、高活性的壳聚糖降解产物壳寡糖（Chitooligosaccharde），并用于微藻的絮凝富集，将大大改善其实际的应用效果。笔者通过制备壳寡糖，采用不同浓度的壳寡糖及其复合聚合氯化铝富集微藻。
1 材料与方法
1.1壳寡糖制备 参照杨宇民等[5]的方法。供试壳聚糖脱乙酰度90.5%，购自南通兴成生化有限公司。准确称取20 g 壳聚糖于1 L 三颈瓶中，加入400 ml浓度2%的双氧水溶液，40～50 ℃下搅拌反应2 h。停止反应后，在布氏漏斗上抽滤。滤液在旋转蒸发仪上减压蒸馏，浓缩到一定程度后，加入3 倍体积的浓度95%乙醇，析出白色沉淀，过滤。将沉淀以尽可能少的水溶解，再加入3 倍体积的浓度95%乙醇，过滤。操作重复3次。将沉淀用红外线快速干燥器烘干，在真空干燥器中干燥保存。
1.2微藻的培养供试绿色巴夫藻（Pavlovaviridis Tseng，Chen et Zhang）和小球藻（Chloreiia spp.）由江苏省海洋水产研究所提供。培养基配方和培养方法参照陈明耀[6]方法。
1.3试验方法 将藻液稀释到适宜浓度，取500 ml 于800 ml 烧杯中，置于搅拌器下，加一定体积的100 mg/L壳寡糖母液，以250 r/min搅拌1 min，再加一定体积的100 mg/L聚合氯化铝溶液（PAC，中国科学院生态环境研究中心提供），继续搅拌1 min后，以50 r/min慢速搅拌10 min，静置沉淀0.5 h，于烧杯底部上方约1/3处取样，测定密度。
2 结果与分析
2.1不同浓度的壳寡糖对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集的影响由图1可知，加入壳寡糖至终浓度为0、10、20、30、40、50 mg/L，沉降0.5 h后，烧杯底部上方1/3处绿色巴夫藻的密度分别为4.2×105、4.9×105、3.8×106、6.8×106、4.3×107和4.6×107个/ml；加入壳寡糖至终浓度为0、10、20、30、40、50 mg/L，沉降0.5 h后，烧杯底部上方1/3处小球藻的密度分别为5.7×105、1.0×106、7.4×106、2.9×107、7.3×107和1.0×108个/ml。这表明高浓度的壳寡糖对绿色巴夫藻和小球藻有明显的促沉降作用。
图1 不同浓度的壳寡糖对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集的影响2.2不同浓度的聚合氯化铝对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集的影响聚合氯化铝被广泛用于水体除藻[7]。为了研究它对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集的影响，加入聚合氯化铝至终浓度为0、3、6、9、12、15 mg/L，沉降0.5 h。由图2可知，烧杯底部上方1/3处绿色巴夫藻的密度分别为2.9×105、3.4×105、1.0×107、1.6×107、1.5×106和1.7×107个/ml；烧杯底部上方1/3处小球藻的密度分别为1.0×106、1.4×106、8.0×106、1.1×107、1.3×107和1.3×107个/ml。研究表明，6 mg/L聚合氯化铝可以有效地促进微藻絮凝。
图2不同浓度的聚合氯化铝对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集的影响2.3壳寡糖/聚合氯化铝混合剂对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集的影响微藻培养液中加入壳寡糖至终浓度为0、10、20、30、40、50 mg/L后，搅拌1 min，分别加入聚合氯化铝至终浓度为6 mg/L，沉降0.5 h。由图3可知，烧杯底部上方1/3处绿色巴夫藻的密度分别为1.3×107、2.9×107、3.7×107、8.2×107、1.2×108、1.4×108个/ml；小球藻的密度分别为9.9×106、4.2×107、5.1×107、9.8×107、1.1×108、1.4×108个/ml。壳寡糖/聚合氯化铝混合剂对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集具有协同效应。
图3壳寡糖/聚合氯化铝混合剂对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集的影响3 讨论 采用絮凝方法富集水体中的微藻已越来越受到人们的重视。常用的絮凝剂包括各种铁盐、铝盐、高岭土以及各种黏土矿物质等。有研究表明，不同浓度的絮凝剂对微藻的沉降都具有一定的效果[4，8-9]。但是，这些方法均用于水质净化，没有考虑对藻类存活、叶绿素含量、营养物质含量的影响以及后续的使用效果。因此，采用高效、安全、无毒的微藻絮凝剂用于促进微藻的沉降和采收，一直是水产养殖、藻类功能食品的开发等产业亟需解决的问题。
微藻在生长过程中分泌一些酸性物质，因而细胞表面带有负电荷。虽然与普通的阳离子型高分子絮凝剂相比，壳聚糖属于弱阳离子型，但是具有很强的促絮凝效应[10]。壳聚糖安全无毒，具有非常好的生物相容性，但水不（低）溶性限制其大规模的使用。有研究表明，低分子量的解聚的水溶性壳聚糖及其衍生物具有更强的生物活性[5]。研究表明，壳聚糖的降解产物壳寡糖仍保持促进微藻沉降的性质。这为微藻在水产养殖、藻类功能食品的大规模养殖采收提供重要的参考依据。
研究还表明，壳聚糖和聚合氯化铝的混合使用可以极大地改善微藻的沉降效果。有研究表明，聚合氯化铝和其他无机盐或红土的联合使用可以促进微藻的絮凝[9]。这与该研究结果相一致。壳聚糖和聚合氯化铝在微藻沉降中的协同效应，可能与它们都带有正电荷、增加藻类与阳离子的结合机率相关。该研究结果尚需进一步证实。但是，壳聚糖和少量聚合氯化铝搭配使用，可以大大地避免聚合氯化铝试剂过度使用所带来的负面影响。
参考文献
[1] 张跃群，王勇军.微藻的营养价值及其应用[J].生物学教学，2002，27（6）：42-44.
[2] HEMAISWARYA S，RAJA R，RAVI KUMAR R，et al. Microalgae：a sustainable feed source for aquaculture[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2011，27（8）：1737-1746.
[3] YUSUF CHISTI. Biodiesel from microalgae[J].Biotechnology Advances，2007，25（3）：294-306.
[4] 李若慧，叶晓，程艳玲.壳聚糖絮凝微藻富集的研究进展[J].安徽农业科学，2012，40（3）：1626-1628.
[5] 杨宇民，马振祥，尹继成，等.系列水溶性壳聚糖衍生物的抑菌性能研究[J].中国公共卫生，2005，21（9）：1080-1081.
[6] 陈明耀.生物饵料培养[M].北京：中国农业出版社，1995：33-71.
[7] 高健，赵春禄.传统PAC混凝除藻方法的改进[J].青岛科技大学学报，2005，26（2）：120-123.
[8] 罗岳平，施周，王仕汇，等.用粘土作助凝剂提高聚合氯化铝除藻效果的研究[J].中国给水排水，2007，23（17）：61-65.
[9] 何维，朱毅，肖强华，等.红土复合聚合氯化铝以及三氯化铁去除水华藻类的研究[J].生态环境学报，2010，19（3）：550-555.
[10] 蒋挺大.壳聚糖[M].2版.北京：化学工业出版社，2007：248-249.安徽农业科学，Journal
关键词壳寡糖； 聚合氯化铝；微藻；沉降
中图分类号S931.1文献标识码A文章编号0517-6611（2014）07-01905-02
基金项目江苏省“333工程”科研资助项目（BRA2012066）；江苏省高校科研成果产业化推进项目（JHB2011C71）；南通市农业科技创新与产业化项目（HL2012017）。
作者简介张跃群（1968-） ，女，江苏如皋人，教授，硕士，从事植物生理学的教学与科研工作。
收稿日期20140211水体中的微藻又称单细胞藻类，个体大小从几微米到几十微米。除了调节海洋和江河湖泊的碳、氧循环外，这一庞大的、种类繁多的微小植物组成的生态类群中一些种类还具有极其重要的营养价值[1]。因而，微藻被广泛用于水产经济动物的（开口）饵料以及人类的功能食品[2]，甚至被作为有潜力完全取代石油用于生产运输用燃料的生物质资源[3]。大规模生产微藻仍需解决采收的难题。传统过滤和离心法大大增加了生产成本和生产周期，因此采用合适的絮凝剂加速微藻的富集越来越受到人们的关注。
与无机盐如聚合氯化铝、三氯化铁以及黏土凝聚法相比，壳聚糖絮凝采收微藻具有用量少、效率高、无毒等特点[4]。然而，由于壳聚糖是高分子化合物，分子量通常在几十万至上百万，且分子结构紧密，不能溶于水，从而限制其应用。开发水溶性的、高活性的壳聚糖降解产物壳寡糖（Chitooligosaccharde），并用于微藻的絮凝富集，将大大改善其实际的应用效果。笔者通过制备壳寡糖，采用不同浓度的壳寡糖及其复合聚合氯化铝富集微藻。
1 材料与方法
1.1壳寡糖制备 参照杨宇民等[5]的方法。供试壳聚糖脱乙酰度90.5%，购自南通兴成生化有限公司。准确称取20 g 壳聚糖于1 L 三颈瓶中，加入400 ml浓度2%的双氧水溶液，40～50 ℃下搅拌反应2 h。停止反应后，在布氏漏斗上抽滤。滤液在旋转蒸发仪上减压蒸馏，浓缩到一定程度后，加入3 倍体积的浓度95%乙醇，析出白色沉淀，过滤。将沉淀以尽可能少的水溶解，再加入3 倍体积的浓度95%乙醇，过滤。操作重复3次。将沉淀用红外线快速干燥器烘干，在真空干燥器中干燥保存。
1.2微藻的培养供试绿色巴夫藻（Pavlovaviridis Tseng，Chen et Zhang）和小球藻（Chloreiia spp.）由江苏省海洋水产研究所提供。培养基配方和培养方法参照陈明耀[6]方法。
1.3试验方法 将藻液稀释到适宜浓度，取500 ml 于800 ml 烧杯中，置于搅拌器下，加一定体积的100 mg/L壳寡糖母液，以250 r/min搅拌1 min，再加一定体积的100 mg/L聚合氯化铝溶液（PAC，中国科学院生态环境研究中心提供），继续搅拌1 min后，以50 r/min慢速搅拌10 min，静置沉淀0.5 h，于烧杯底部上方约1/3处取样，测定密度。
2 结果与分析
2.1不同浓度的壳寡糖对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集的影响由图1可知，加入壳寡糖至终浓度为0、10、20、30、40、50 mg/L，沉降0.5 h后，烧杯底部上方1/3处绿色巴夫藻的密度分别为4.2×105、4.9×105、3.8×106、6.8×106、4.3×107和4.6×107个/ml；加入壳寡糖至终浓度为0、10、20、30、40、50 mg/L，沉降0.5 h后，烧杯底部上方1/3处小球藻的密度分别为5.7×105、1.0×106、7.4×106、2.9×107、7.3×107和1.0×108个/ml。这表明高浓度的壳寡糖对绿色巴夫藻和小球藻有明显的促沉降作用。
图1 不同浓度的壳寡糖对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集的影响2.2不同浓度的聚合氯化铝对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集的影响聚合氯化铝被广泛用于水体除藻[7]。为了研究它对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集的影响，加入聚合氯化铝至终浓度为0、3、6、9、12、15 mg/L，沉降0.5 h。由图2可知，烧杯底部上方1/3处绿色巴夫藻的密度分别为2.9×105、3.4×105、1.0×107、1.6×107、1.5×106和1.7×107个/ml；烧杯底部上方1/3处小球藻的密度分别为1.0×106、1.4×106、8.0×106、1.1×107、1.3×107和1.3×107个/ml。研究表明，6 mg/L聚合氯化铝可以有效地促进微藻絮凝。
图2不同浓度的聚合氯化铝对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集的影响2.3壳寡糖/聚合氯化铝混合剂对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集的影响微藻培养液中加入壳寡糖至终浓度为0、10、20、30、40、50 mg/L后，搅拌1 min，分别加入聚合氯化铝至终浓度为6 mg/L，沉降0.5 h。由图3可知，烧杯底部上方1/3处绿色巴夫藻的密度分别为1.3×107、2.9×107、3.7×107、8.2×107、1.2×108、1.4×108个/ml；小球藻的密度分别为9.9×106、4.2×107、5.1×107、9.8×107、1.1×108、1.4×108个/ml。壳寡糖/聚合氯化铝混合剂对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集具有协同效应。
图3壳寡糖/聚合氯化铝混合剂对绿色巴夫藻和小球藻絮凝富集的影响3 讨论 采用絮凝方法富集水体中的微藻已越来越受到人们的重视。常用的絮凝剂包括各种铁盐、铝盐、高岭土以及各种黏土矿物质等。有研究表明，不同浓度的絮凝剂对微藻的沉降都具有一定的效果[4，8-9]。但是，这些方法均用于水质净化，没有考虑对藻类存活、叶绿素含量、营养物质含量的影响以及后续的使用效果。因此，采用高效、安全、无毒的微藻絮凝剂用于促进微藻的沉降和采收，一直是水产养殖、藻类功能食品的开发等产业亟需解决的问题。
微藻在生长过程中分泌一些酸性物质，因而细胞表面带有负电荷。虽然与普通的阳离子型高分子絮凝剂相比，壳聚糖属于弱阳离子型，但是具有很强的促絮凝效应[10]。壳聚糖安全无毒，具有非常好的生物相容性，但水不（低）溶性限制其大规模的使用。有研究表明，低分子量的解聚的水溶性壳聚糖及其衍生物具有更强的生物活性[5]。研究表明，壳聚糖的降解产物壳寡糖仍保持促进微藻沉降的性质。这为微藻在水产养殖、藻类功能食品的大规模养殖采收提供重要的参考依据。
研究还表明，壳聚糖和聚合氯化铝的混合使用可以极大地改善微藻的沉降效果。有研究表明，聚合氯化铝和其他无机盐或红土的联合使用可以促进微藻的絮凝[9]。这与该研究结果相一致。壳聚糖和聚合氯化铝在微藻沉降中的协同效应，可能与它们都带有正电荷、增加藻类与阳离子的结合机率相关。该研究结果尚需进一步证实。但是，壳聚糖和少量聚合氯化铝搭配使用，可以大大地避免聚合氯化铝试剂过度使用所带来的负面影响。
参考文献
[1] 张跃群，王勇军.微藻的营养价值及其应用[J].生物学教学，2002，27（6）：42-44.
[2] HEMAISWARYA S，RAJA R，RAVI KUMAR R，et al. Microalgae：a sustainable feed source for aquaculture[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2011，27（8）：1737-1746.
[3] YUSUF CHISTI. Biodiesel from microalgae[J].Biotechnology Advances，2007，25（3）：294-306.
[4] 李若慧，叶晓，程艳玲.壳聚糖絮凝微藻富集的研究进展[J].安徽农业科学，2012，40（3）：1626-1628.
[5] 杨宇民，马振祥，尹继成，等.系列水溶性壳聚糖衍生物的抑菌性能研究[J].中国公共卫生，2005，21（9）：1080-1081.
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[8] 罗岳平，施周，王仕汇，等.用粘土作助凝剂提高聚合氯化铝除藻效果的研究[J].中国给水排水，2007，23（17）：61-65.
[9] 何维，朱毅，肖强华，等.红土复合聚合氯化铝以及三氯化铁去除水华藻类的研究[J].生态环境学报，2010，19（3）：550-555.
[10] 蒋挺大.壳聚糖[M].2版.北京：化学工业出版社，2007：248-249.安徽农业科学，Journal