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摘要：目的建立高效液相色谱法测定养阴淸肺口服液（无糖型）中丹皮酚的含量方法。方法色谱柱为依利特-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相：乙腈-水-冰醋酸（33∶67∶1.5）；流速：1.0 mL.min-1；检测波长：274 nm。结果丹皮酚的浓度在0.2001～1.6008 μg.mL-1范围内，线性关系良好（r=0.9991，n=5），平均回收率102.9﹪，RSD为1.19%。结论本法准确、快速，简便可靠，结果稳定，可用于养阴淸肺口服液（无糖型）中丹皮酚的含量测定。
关键词：HPLC法；养阴淸肺口服液（无糖型）；丹皮酚；含量测定
中图分类号：R284.2文献标志码：A文章编号：1007-2349（2014）03-0051-02
养阴淸肺口服液（无糖型）由牡丹皮、地黄、玄参、白芍等8味中药组成，具有养阴润肺，淸热利咽的作用，用于咽喉干燥疼痛。其中牡丹皮具有淸热凉血，活血化瘀的功效[1]，主要成分为丹皮酚。养阴淸肺口服液（无糖型）现行质量标准为国家药品监督管理局标准（试行）（YBZ27812005）[2]，其丹皮酚含量测定为蒸馏-紫外分光光度法。本实验选择丹皮酚为指标，用HPLC法对养阴淸肺口服液（无糖型）进行含量测定。
1仪器与试剂
戴安HPLC SUMMIT 系統高效液相色谱仪（P680泵，ASI-100自动进样器，柱温箱，UltiMate 3000紫外检测器，Chromeleon化学工作站），超声波淸洗仪（中船七院七二六所），塞多利斯 CP324S 电子天平。丹皮酚对照品（110708-200506，中国药品生物制品检定所）。甲醇为色谱纯，乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，冰醋酸为分析纯。养阴淸肺口服液（批号20121001，20121002，20121003呼伦贝尔松鹿制药有限公司 规格：每支装10 mL）。
2实验方法
2.1色谱条件色谱柱为依利特-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相：乙腈-水-冰醋酸（33∶67∶2）；流速：1.0 mL.min-1；柱温：30℃；检测波长：274 nm；进样量：10 μL。丹皮酚的保留时间约为12.83 min。丹皮酚对照品、供试品及阴性样品的色谱图见图1。
2.2溶液的制备
2.2.1对照品溶液的制备精密称取丹皮酚对照品20.01 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，再精密量取1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得0.04 002 mg.mL-1丹皮酚对照品溶液。
2.2.2供试品溶液的制备取养阴淸肺口服液（无糖型）5支，混匀，精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇适量摇匀，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。
2.2.3阴性样品溶液的制备按处方比例及制法，制得除牡丹皮的阴性样品。取相当于供试品的量，按供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。
3实验结果
3.1线性实验吸取2.2.1项下对照品溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤。分别精密吸取5，10，15，20，25 μL进样，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。结果表明，丹皮酚的浓度在0.2001～1.6008 μg.mL-1 范围内线性关系良好，y=4.9736+28.6344x，r=0.9991（n=5）。
3.2精密度实验精密吸取2.2.1项下对照品溶液10 μL，连续进样6次，测得丹皮酚的峰面积y分别为18.3117，18.3704，18.3499，18.2943，18.3816，18.3714。RSD为0.19%。表明所选色谱条件系统稳定。
3.3空白实验吸取2.2.3项下阴性样品溶液，经0.45 μ m 微孔滤膜过滤，精密吸取10 μ L，注入液相色谱仪，结果，在对照品和供试品色谱相应的保留时间，阴性样品无色谱峰，表明阴性样品不干扰测定，色谱图见图1。
3.4稳定性实验取同一样品，按照2.2.2项下制备，分别在0，4，8，12 h测定峰面积为19.0357，19.1021，19.2214，19.3578，RSD为0.74%，说明丹皮酚甲醇溶液在12 h内稳定性较好。
3.5重复性实验取同一批样品（批号：20121001）4份，按2.2.2项下制备，测定丹皮酚的含量，其含量的RSD为0.17%。
3.6加样回收率实验取已知含量的养阴淸肺口服液（无糖型）（批号：20121001）4份，精密量取5 mL，置25 mL容量瓶中，分别加入不同浓度丹皮酚对照品溶液，加入甲醇溶液并稀释至刻度，混匀。测得丹皮酚的回收率见表1。
4.1检测波长的选择文献报到，检测波长大多采用274 nm。取丹皮酚对照品溶液进行紫外可见光波段扫描（200～900 nm）扫描，结果在274 nm处有最大吸收，故选用274 nm作为检测波长。
4.2流动相的考察根据文献资料报道，当流动相比例为甲醇-水（75：25）[3]和乙腈-水-冰醋酸（33∶67∶2）[4]下都能出峰，而在反复验证下，在本实验环境下，乙腈-水-冰醋酸（33∶67∶1.5）时，出峰的保留时间合适，分离效果比较好，所以本实验的流动相比例为乙腈-水-冰醋酸（33∶67∶1.5）。
4.3不同提取方法的考察取同一批号的样品，分别采用水蒸气蒸馏法，有机溶剂提取法，直接加甲醇溶剂定量稀释法，按样品测定法测定含量，含量几无差别，故采用甲醇溶剂定量稀释法。
4.4不同溶剂的考察采用甲醇、无水乙醇、95%乙醇为溶剂，按样品测定方法测定，含量分别为0.415 mg/mL、0.387 mg/mL、0.382 mg/mL，表明甲醇为溶剂效果好。
5结论
该方法准确、快速，简便可靠，结果稳定，可用于养阴淸肺口服液（无糖型）的含量测定。
参考文献：
[1]中华人民共和国国家药典委员会.中国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2010：160.
[2]国家药品监督管理局标准（试行）（YBZ27812005）.
[3]李健，陈妍，徐金波.液相色谱法测定养阴淸肺颗粒中丹皮酚的含量[J].天津中医药，2004，21（1）：72-73.
[4]赵刚，李月霞，吴贵华.反相高效液相色谱法测定养阴淸肺丸中丹皮酚的含量[J].天津药学，2005，17（5）：14-15.
关键词：HPLC法；养阴淸肺口服液（无糖型）；丹皮酚；含量测定
中图分类号：R284.2文献标志码：A文章编号：1007-2349（2014）03-0051-02
养阴淸肺口服液（无糖型）由牡丹皮、地黄、玄参、白芍等8味中药组成，具有养阴润肺，淸热利咽的作用，用于咽喉干燥疼痛。其中牡丹皮具有淸热凉血，活血化瘀的功效[1]，主要成分为丹皮酚。养阴淸肺口服液（无糖型）现行质量标准为国家药品监督管理局标准（试行）（YBZ27812005）[2]，其丹皮酚含量测定为蒸馏-紫外分光光度法。本实验选择丹皮酚为指标，用HPLC法对养阴淸肺口服液（无糖型）进行含量测定。
1仪器与试剂
戴安HPLC SUMMIT 系統高效液相色谱仪（P680泵，ASI-100自动进样器，柱温箱，UltiMate 3000紫外检测器，Chromeleon化学工作站），超声波淸洗仪（中船七院七二六所），塞多利斯 CP324S 电子天平。丹皮酚对照品（110708-200506，中国药品生物制品检定所）。甲醇为色谱纯，乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，冰醋酸为分析纯。养阴淸肺口服液（批号20121001，20121002，20121003呼伦贝尔松鹿制药有限公司 规格：每支装10 mL）。
2实验方法
2.1色谱条件色谱柱为依利特-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相：乙腈-水-冰醋酸（33∶67∶2）；流速：1.0 mL.min-1；柱温：30℃；检测波长：274 nm；进样量：10 μL。丹皮酚的保留时间约为12.83 min。丹皮酚对照品、供试品及阴性样品的色谱图见图1。
2.2溶液的制备
2.2.1对照品溶液的制备精密称取丹皮酚对照品20.01 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，再精密量取1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得0.04 002 mg.mL-1丹皮酚对照品溶液。
2.2.2供试品溶液的制备取养阴淸肺口服液（无糖型）5支，混匀，精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇适量摇匀，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。
2.2.3阴性样品溶液的制备按处方比例及制法，制得除牡丹皮的阴性样品。取相当于供试品的量，按供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。
3实验结果
3.1线性实验吸取2.2.1项下对照品溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤。分别精密吸取5，10，15，20，25 μL进样，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。结果表明，丹皮酚的浓度在0.2001～1.6008 μg.mL-1 范围内线性关系良好，y=4.9736+28.6344x，r=0.9991（n=5）。
3.2精密度实验精密吸取2.2.1项下对照品溶液10 μL，连续进样6次，测得丹皮酚的峰面积y分别为18.3117，18.3704，18.3499，18.2943，18.3816，18.3714。RSD为0.19%。表明所选色谱条件系统稳定。
3.3空白实验吸取2.2.3项下阴性样品溶液，经0.45 μ m 微孔滤膜过滤，精密吸取10 μ L，注入液相色谱仪，结果，在对照品和供试品色谱相应的保留时间，阴性样品无色谱峰，表明阴性样品不干扰测定，色谱图见图1。
3.4稳定性实验取同一样品，按照2.2.2项下制备，分别在0，4，8，12 h测定峰面积为19.0357，19.1021，19.2214，19.3578，RSD为0.74%，说明丹皮酚甲醇溶液在12 h内稳定性较好。
3.5重复性实验取同一批样品（批号：20121001）4份，按2.2.2项下制备，测定丹皮酚的含量，其含量的RSD为0.17%。
3.6加样回收率实验取已知含量的养阴淸肺口服液（无糖型）（批号：20121001）4份，精密量取5 mL，置25 mL容量瓶中，分别加入不同浓度丹皮酚对照品溶液，加入甲醇溶液并稀释至刻度，混匀。测得丹皮酚的回收率见表1。
4.1检测波长的选择文献报到，检测波长大多采用274 nm。取丹皮酚对照品溶液进行紫外可见光波段扫描（200～900 nm）扫描，结果在274 nm处有最大吸收，故选用274 nm作为检测波长。
4.2流动相的考察根据文献资料报道，当流动相比例为甲醇-水（75：25）[3]和乙腈-水-冰醋酸（33∶67∶2）[4]下都能出峰，而在反复验证下，在本实验环境下，乙腈-水-冰醋酸（33∶67∶1.5）时，出峰的保留时间合适，分离效果比较好，所以本实验的流动相比例为乙腈-水-冰醋酸（33∶67∶1.5）。
4.3不同提取方法的考察取同一批号的样品，分别采用水蒸气蒸馏法，有机溶剂提取法，直接加甲醇溶剂定量稀释法，按样品测定法测定含量，含量几无差别，故采用甲醇溶剂定量稀释法。
4.4不同溶剂的考察采用甲醇、无水乙醇、95%乙醇为溶剂，按样品测定方法测定，含量分别为0.415 mg/mL、0.387 mg/mL、0.382 mg/mL，表明甲醇为溶剂效果好。
5结论
该方法准确、快速，简便可靠，结果稳定，可用于养阴淸肺口服液（无糖型）的含量测定。
参考文献：
[1]中华人民共和国国家药典委员会.中国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2010：160.
[2]国家药品监督管理局标准（试行）（YBZ27812005）.
[3]李健，陈妍，徐金波.液相色谱法测定养阴淸肺颗粒中丹皮酚的含量[J].天津中医药，2004，21（1）：72-73.
[4]赵刚，李月霞，吴贵华.反相高效液相色谱法测定养阴淸肺丸中丹皮酚的含量[J].天津药学，2005，17（5）：14-15.