建立一种基于非标记探针结合高分辨率熔解曲线分析快速区分第1类整合子可变区启动子种类的方法。
方法PCR扩增质粒pACW (PcW)、pACWP2 (PcW－P2)含可变区启动子区域的DNA片段，再分别以纯化的PCR产物为模板，用扩增子高分辨率熔解曲线分析对P2启动子进行区分。以质粒pACS (PcS)、pACH2 (PcH2)、pACH1 (PcH1)、pACW (PcW)及肺炎克雷伯菌HS07－68(PcWTGN－10)、HS05－1792(PcH2TGN－10)基因组DNA为模板，结合定点突变，PCR扩增获得分别含8种不同Pc启动子序列的DNA片段，再分别以纯化的PCR产物为模板，联合运用扩增子和非标记探针高分辨率熔解曲线分析对8种不同Pc启动子进行区分。运用上述方法对2004—2007年95株非重复分离自华山医院住院患者尿液标本的第1类整合酶阳性大肠埃希菌中可变区启动子进行分析，并与测序结果进行比对。
结果P2启动子扩增子熔解曲线的熔链温度(Tm)值明显高于无活性的P2启动子，通过扩增子高分辨率熔解曲线分析可将两者区分开，95株大肠埃希菌109个第1类整合子中，有2个整合子中检测出P2启动子，与测序结果完全一致。8种不同的Pc启动子通过扩增子高分辨率熔解曲线分析分为3组：PcS、PcSTGN－10；PcW、PcWTGN－10；PcH1、PcH1TGN－10、PcH2 、PcH2TGN－10 。非标记探针高分辨率熔解曲线分析将8种不同的Pc启动子分为4组PcS, PcH1；PcH2，PcW；PcSTGN－10, PcH1TGN－10; PcH2TGN－10，PcWTGN－10。联合运用扩增子和非标记探针高分辨率熔解曲线分析可将8种不同的Pc启动子相互区分开，95株大肠埃希菌109个第1类整合子中，共检测出5种不同的Pc启动子PcS，PcW，PcH1，PcH2TGN－10 ，PcWTGN－10，与测序结果完全一致。
结论本研究成功建立了一种基于非标记探针结合高分辨率熔解曲线分析的方法，用于快速区分第1类整合子可变区启动子，该方法结果准确、费用低，可用于临床对第1类整合子可变区启动子多态性的研究。(中华检验医学杂志，2017, 40: 95－100)