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摘要：
为筛选出可用于苹果轮纹病防治的生物源杀菌剂，采用菌丝生长速率法测定了9种生物源杀菌剂对苹果轮纹病菌菌丝生长的抑制效果。结果表明：测试药剂对苹果轮纹病菌丝生长均有较好的抑制效果。其中，室内毒力最强的3种药剂是50亿cfu/g多粘类芽孢杆菌（WP）、100亿cfu/g枯草芽孢杆菌（WP）和300亿cfu/g解淀粉芽孢杆菌（WP），EC50分别为3155×10-2μg/mL、3429×10-2μg/mL和8856×10-2μg/mL;室内毒力相对较弱的为1000亿cfu/g荧光假单胞杆菌（WP）、5%香芹酚（AS）、大蒜油（EC）、03%丁子香酚（SL）、1%蛇床子素（EW）、3亿cfu/g哈茨木霉菌（WP），EC50分别为7556μg/mL、1480×10μg/mL、1719×10μg/mL、5901×10μg/mL、6601×10μg/mL、1181×102μg/mL。综上，50亿cfu/g多粘类芽孢杆菌（WP）、100亿cfu/g枯草芽孢杆菌（WP）和300亿/g解淀粉芽孢杆菌（WP）有望成为防治苹果轮纹病的候选生物源杀菌剂。
关键词：
苹果轮纹病菌;生物源杀菌剂;毒力测定
中图分类号：S-3
文献标识码：A
DOI：1019754/jnyyjs20200630003
引言
蘋果（Malus domestica Borkh），属于蔷薇科苹果属植物，是世界范围内广泛种植的经济作物。目前，我国苹果种植面积和产量均居世界第一，在我国农业产业经济发展和果农脱贫致富中发挥重要作用。然而，病虫害的高发频发严重影响苹果产业的健康可持续发展。近年来，苹果轮纹病在我国各苹果产地均有不同程度发生，严重时田间病果率可达70%～80%，且贮藏期仍可持续发病，已成为继苹果树腐烂病、早期落叶病之后的第3大病害，给果农带来了巨大的经济损失[1，2]。苹果轮纹病病原菌为葡萄座腔菌[Botryosphaeria dothidea（MougexFr）Ces et De Not]，主要为害苹果的枝干及果实。目前生产上仍主要依赖苯并咪唑类、三唑类、甲氧基丙烯酸脂类等化学药剂进行病害防控。但果农长时间不合理、不规范施用化学农药，不仅容易使病原菌产生抗药性，而且还会对果品安全及果园生态环境造成严重影响。据报道，生产上已多次发现对多菌灵和甲基硫菌灵产生抗药性的菌株[3-5]。近年来，研究发现病原菌对苯醚甲环唑、戊唑醇的敏感性正在下降，存在着较大的抗性风险[6]。
生物源农药是利用生物产生的天然活性物质或生物本身制作而成，有助于减少化学农药对环境造成的污染。农业农村部提出农药使用负增长，建立环境友好型农业生产的要求为生物源农药的应用提供了广阔的前景。本实验通过测定9种生物源杀菌剂对苹果轮纹病菌菌丝生长的抑制作用，旨在筛选出高效低毒的生物源杀菌剂，为生产上安全高效防治苹果轮纹病提供参考。
1材料与方法
11试验材料
111供试菌株
苹果轮纹病菌由西北农林科技大学果树病害病原生物学及综合防控实验室分离保存。
112培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），配方：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g，蒸馏水定容至1000mL后，经121℃高压蒸汽灭菌30min。
12试验方法
121杀菌剂对病菌菌丝生长的抑制效果测定
采用菌丝生长速率法[7]，将9种供试药剂分别稀释到合适的浓度梯度，待PDA培养基冷却至45℃左右时吸取3mL至盛有27mL PDA培养基的三角瓶中，摇匀后均匀分至3个灭菌培养皿制成含药培养基。每种药剂设置5个浓度并设置加入无菌水的空白对照，每个浓度设置3次机械重复，3次生物学重复。25℃黑暗培养3d的苹果轮纹病菌菌落边缘处用灭菌的打孔器打下直径5mm的菌饼，倒置于含药培养基中央并放置于25℃黑暗条件下培养约3d，利用十字交叉法测量皿内菌落直径，计算出菌丝生长抑制率。
抑制率=[（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）]×100%
122数据统计分析
采用Excel 2007进行数据处理，以各药剂浓度的对数值为横坐标（x），菌丝生长抑制率对应的几率值为纵坐标（y），作线性回归分析，计算不同药剂对苹果轮纹病菌的EC50值和相关系数R2。
2结果与分析
结果表明，9种生物源杀菌剂对轮纹病菌菌丝生长均有一定的抑制作用。其中，室内毒力最强的3种药剂是50亿cfu/g多粘类芽孢杆菌（WP）、100亿cfu/g枯草芽孢杆菌（WP）和300亿cfu/g解淀粉芽孢杆菌（WP），EC50分别为3155×10-2μg/mL、3429×10-2μg/mL、和8856×10-2μg/mL;室内毒力相对较弱的为1000亿cfu/g荧光假单胞杆菌（WP）、5%香芹酚（AS）、大蒜油（EC）、03%丁子香酚（SL）、1%蛇床子素（EW）、3亿cfu/g哈茨木霉菌（WP），对菌丝生长的EC50分别为7556μg/mL、1480×10μg/mL、1719×μg/mL、5901×10μg/mL、6601×10μg/mL、1181×102μg/mL，均在前3种EC50的100倍以上，但仍有一定的抑制作用。
3结论与讨论
目前，我国苹果产区病虫害防控仍主要依赖化学农药。长期过量使用化学农药不仅有着巨大的抗药性风险，而且对人类健康和环境也有巨大的隐患[8]。生物农药由于其所具备的环境友好性等特点在世界范围内得到了快速发展。世界上生物农药使用最多的国家为墨西哥、美国和加拿大，3国生物农药使用量占世界总量的44%[9];在欧洲，生物农药在农药市场上也占有504%的份额。近年来，随着人们健康意识、环保意识的逐渐增强，生物农药这一领域引起了社会的广泛关注，得到了我国各级政府、科研机构及相关企业的大力支持，根据相关统计，我国已注册的生物农药品种为140种，占农药总品种的15%，年产量大约在12～13万t，占农药总药量的12%。 本研究通过测定9种生物源杀菌剂对苹果轮纹病菌菌丝生长的抑制作用，筛选出了室内毒力较强的3种药剂，分别为50亿cfu/g多粘类芽孢杆菌、100亿cfu/g枯草芽孢杆菌和300亿cfu/g解淀粉芽孢杆菌，3种药剂的EC50均<01μg/mL。杨炜华[10]等研究表明，927%甲基硫菌灵原粉对苹果轮纹病菌菌丝生长的EC50为7102×10-1μg/mL;马志强[11]等研究表明，50%多菌灵可湿性粉剂对苹果轮纹病菌菌丝生长的EC50为36×10-3μg/mL;李娜[12]等研究表明，10%的苯醚甲环唑、430g/L戊唑醇悬浮剂对苹果轮纹病菌菌丝生长的EC50分别为17×10-2μg/mL和114×10-1μg/mL。由此可见，本实验筛选出的3种生物源杀菌剂对苹果轮纹病菌菌丝生长的抑制作用相比于市场上常见的化学药剂相差并不大。上述3种生物源药剂有望成为苹果轮纹病防控的化学药剂替代药剂。但由于田间环境相对实验室更加复杂多变，可能会导致药剂的稳定性和速效性较差，在生产中大面积推广应用之前要进一步进行田间应用效果评估。
参考文献
[1]
杨倩，范方林.苹果枝干轮纹病防治技术[J].山西果树，2019（05）：92.
[2]李广旭，沈永波，高艳敏，陈杰，Jie Youl Uhm. 苹果轮纹病菌侵染机制的研究（英文）[J].果树学报，2007，24（01）：16-20.
[3]刘鹏，周增强，国立耘.苹果轮纹病菌对多菌灵、亚胺唑和丙环唑的敏感性[J].果树学报，2009，26（06）：907-911.
[4]李晓军，范昆，曲健禄，张勇，王涛，亓彬.苹果轮纹病菌对多菌灵的敏感性测定[J].果树学报，2009，26（04）：516-519.
[5]杨炜華，刘开启.苹果轮纹病菌对多菌灵、甲基硫菌灵的抗药性测定[J].植物保护学报，2002，29（02）：191-192.
[6]刘保友，张伟，栾炳辉，王培松，王英姿.苹果轮纹病菌对苯醚甲环唑和氟硅唑的敏感性及其交互抗性[J].植物病理学报，2013，43（05）：541-548.
[7]孙广宇，宗兆锋.植物病理学实验技术[M].北京：中国农业出版社，2002：139-146.
[8]王丁，杨雪，刘春雷，常慧萍，张丽琴.生物农药研究进展[J].绿色科技，2018（24）：179-181.
[9]王金楠.浅谈生物农药的特点及发展现状[J].现代化农业，2014（11）：4-5.
[10]杨炜华，刘开启.苹果轮纹病菌对多菌灵、甲基硫菌灵的抗药性测定[J].植物保护学报，2002，29（02）：191-192.
[11]马志强，李红霞，袁章虎，张小风.苹果轮纹病菌对多菌灵抗药性监测初报[J].农药学学报，2000（03）：94-96.
[12]李娜，刘丽，曹克强.几种化学杀菌剂对苹果轮纹病的药效评价[J].果树学报，2009，26（06）：855-859.
（责任编辑周康）
为筛选出可用于苹果轮纹病防治的生物源杀菌剂，采用菌丝生长速率法测定了9种生物源杀菌剂对苹果轮纹病菌菌丝生长的抑制效果。结果表明：测试药剂对苹果轮纹病菌丝生长均有较好的抑制效果。其中，室内毒力最强的3种药剂是50亿cfu/g多粘类芽孢杆菌（WP）、100亿cfu/g枯草芽孢杆菌（WP）和300亿cfu/g解淀粉芽孢杆菌（WP），EC50分别为3155×10-2μg/mL、3429×10-2μg/mL和8856×10-2μg/mL;室内毒力相对较弱的为1000亿cfu/g荧光假单胞杆菌（WP）、5%香芹酚（AS）、大蒜油（EC）、03%丁子香酚（SL）、1%蛇床子素（EW）、3亿cfu/g哈茨木霉菌（WP），EC50分别为7556μg/mL、1480×10μg/mL、1719×10μg/mL、5901×10μg/mL、6601×10μg/mL、1181×102μg/mL。综上，50亿cfu/g多粘类芽孢杆菌（WP）、100亿cfu/g枯草芽孢杆菌（WP）和300亿/g解淀粉芽孢杆菌（WP）有望成为防治苹果轮纹病的候选生物源杀菌剂。
关键词：
苹果轮纹病菌;生物源杀菌剂;毒力测定
中图分类号：S-3
文献标识码：A
DOI：1019754/jnyyjs20200630003
引言
蘋果（Malus domestica Borkh），属于蔷薇科苹果属植物，是世界范围内广泛种植的经济作物。目前，我国苹果种植面积和产量均居世界第一，在我国农业产业经济发展和果农脱贫致富中发挥重要作用。然而，病虫害的高发频发严重影响苹果产业的健康可持续发展。近年来，苹果轮纹病在我国各苹果产地均有不同程度发生，严重时田间病果率可达70%～80%，且贮藏期仍可持续发病，已成为继苹果树腐烂病、早期落叶病之后的第3大病害，给果农带来了巨大的经济损失[1，2]。苹果轮纹病病原菌为葡萄座腔菌[Botryosphaeria dothidea（MougexFr）Ces et De Not]，主要为害苹果的枝干及果实。目前生产上仍主要依赖苯并咪唑类、三唑类、甲氧基丙烯酸脂类等化学药剂进行病害防控。但果农长时间不合理、不规范施用化学农药，不仅容易使病原菌产生抗药性，而且还会对果品安全及果园生态环境造成严重影响。据报道，生产上已多次发现对多菌灵和甲基硫菌灵产生抗药性的菌株[3-5]。近年来，研究发现病原菌对苯醚甲环唑、戊唑醇的敏感性正在下降，存在着较大的抗性风险[6]。
生物源农药是利用生物产生的天然活性物质或生物本身制作而成，有助于减少化学农药对环境造成的污染。农业农村部提出农药使用负增长，建立环境友好型农业生产的要求为生物源农药的应用提供了广阔的前景。本实验通过测定9种生物源杀菌剂对苹果轮纹病菌菌丝生长的抑制作用，旨在筛选出高效低毒的生物源杀菌剂，为生产上安全高效防治苹果轮纹病提供参考。
1材料与方法
11试验材料
111供试菌株
苹果轮纹病菌由西北农林科技大学果树病害病原生物学及综合防控实验室分离保存。
112培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），配方：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g，蒸馏水定容至1000mL后，经121℃高压蒸汽灭菌30min。
12试验方法
121杀菌剂对病菌菌丝生长的抑制效果测定
采用菌丝生长速率法[7]，将9种供试药剂分别稀释到合适的浓度梯度，待PDA培养基冷却至45℃左右时吸取3mL至盛有27mL PDA培养基的三角瓶中，摇匀后均匀分至3个灭菌培养皿制成含药培养基。每种药剂设置5个浓度并设置加入无菌水的空白对照，每个浓度设置3次机械重复，3次生物学重复。25℃黑暗培养3d的苹果轮纹病菌菌落边缘处用灭菌的打孔器打下直径5mm的菌饼，倒置于含药培养基中央并放置于25℃黑暗条件下培养约3d，利用十字交叉法测量皿内菌落直径，计算出菌丝生长抑制率。
抑制率=[（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）]×100%
122数据统计分析
采用Excel 2007进行数据处理，以各药剂浓度的对数值为横坐标（x），菌丝生长抑制率对应的几率值为纵坐标（y），作线性回归分析，计算不同药剂对苹果轮纹病菌的EC50值和相关系数R2。
2结果与分析
结果表明，9种生物源杀菌剂对轮纹病菌菌丝生长均有一定的抑制作用。其中，室内毒力最强的3种药剂是50亿cfu/g多粘类芽孢杆菌（WP）、100亿cfu/g枯草芽孢杆菌（WP）和300亿cfu/g解淀粉芽孢杆菌（WP），EC50分别为3155×10-2μg/mL、3429×10-2μg/mL、和8856×10-2μg/mL;室内毒力相对较弱的为1000亿cfu/g荧光假单胞杆菌（WP）、5%香芹酚（AS）、大蒜油（EC）、03%丁子香酚（SL）、1%蛇床子素（EW）、3亿cfu/g哈茨木霉菌（WP），对菌丝生长的EC50分别为7556μg/mL、1480×10μg/mL、1719×μg/mL、5901×10μg/mL、6601×10μg/mL、1181×102μg/mL，均在前3种EC50的100倍以上，但仍有一定的抑制作用。
3结论与讨论
目前，我国苹果产区病虫害防控仍主要依赖化学农药。长期过量使用化学农药不仅有着巨大的抗药性风险，而且对人类健康和环境也有巨大的隐患[8]。生物农药由于其所具备的环境友好性等特点在世界范围内得到了快速发展。世界上生物农药使用最多的国家为墨西哥、美国和加拿大，3国生物农药使用量占世界总量的44%[9];在欧洲，生物农药在农药市场上也占有504%的份额。近年来，随着人们健康意识、环保意识的逐渐增强，生物农药这一领域引起了社会的广泛关注，得到了我国各级政府、科研机构及相关企业的大力支持，根据相关统计，我国已注册的生物农药品种为140种，占农药总品种的15%，年产量大约在12～13万t，占农药总药量的12%。 本研究通过测定9种生物源杀菌剂对苹果轮纹病菌菌丝生长的抑制作用，筛选出了室内毒力较强的3种药剂，分别为50亿cfu/g多粘类芽孢杆菌、100亿cfu/g枯草芽孢杆菌和300亿cfu/g解淀粉芽孢杆菌，3种药剂的EC50均<01μg/mL。杨炜华[10]等研究表明，927%甲基硫菌灵原粉对苹果轮纹病菌菌丝生长的EC50为7102×10-1μg/mL;马志强[11]等研究表明，50%多菌灵可湿性粉剂对苹果轮纹病菌菌丝生长的EC50为36×10-3μg/mL;李娜[12]等研究表明，10%的苯醚甲环唑、430g/L戊唑醇悬浮剂对苹果轮纹病菌菌丝生长的EC50分别为17×10-2μg/mL和114×10-1μg/mL。由此可见，本实验筛选出的3种生物源杀菌剂对苹果轮纹病菌菌丝生长的抑制作用相比于市场上常见的化学药剂相差并不大。上述3种生物源药剂有望成为苹果轮纹病防控的化学药剂替代药剂。但由于田间环境相对实验室更加复杂多变，可能会导致药剂的稳定性和速效性较差，在生产中大面积推广应用之前要进一步进行田间应用效果评估。
参考文献
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[5]杨炜華，刘开启.苹果轮纹病菌对多菌灵、甲基硫菌灵的抗药性测定[J].植物保护学报，2002，29（02）：191-192.
[6]刘保友，张伟，栾炳辉，王培松，王英姿.苹果轮纹病菌对苯醚甲环唑和氟硅唑的敏感性及其交互抗性[J].植物病理学报，2013，43（05）：541-548.
[7]孙广宇，宗兆锋.植物病理学实验技术[M].北京：中国农业出版社，2002：139-146.
[8]王丁，杨雪，刘春雷，常慧萍，张丽琴.生物农药研究进展[J].绿色科技，2018（24）：179-181.
[9]王金楠.浅谈生物农药的特点及发展现状[J].现代化农业，2014（11）：4-5.
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[11]马志强，李红霞，袁章虎，张小风.苹果轮纹病菌对多菌灵抗药性监测初报[J].农药学学报，2000（03）：94-96.
[12]李娜，刘丽，曹克强.几种化学杀菌剂对苹果轮纹病的药效评价[J].果树学报，2009，26（06）：855-859.
（责任编辑周康）