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摘 要： 龍胆苦苷（gentiopicroside）是中药龙胆中的主要药效成分，属于萜类化合物的衍生物。1-羟基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-二磷酸还原酶[1-hydroxy-2-methyl-2-（E）-butenyl-4-diphosphate reductase，HDR]是萜类物质合成途径中的关键酶。为探讨不同光照条件下滇龙胆HDR（GrHDR）基因的表达与龙胆苦苷含量之间的关系，该文以滇龙胆叶片cDNA为模板，采用PCR和TA克隆技术获得GrHDR基因序列，对该序列进行生物信息学分析和表达分析，并采用高效液相色谱法测定龙胆苦苷含量，对该基因表达与龙胆苦苷含量进行比较。结果表明：（1）GrHDR基因（GenBank登录号： KJ917165.1）全长1 398 bp，编码465个氨基酸，推定GrHDR蛋白是亲水且稳定的，相对分子质量是52 281.25 Da，理论等电点是5.32;（2）该蛋白属于LYTB蛋白家族，可能定位于叶绿体上，无信号肽，二级结构主要由α-螺旋（45.16%）、β-转角（6.24%）、无规卷曲（33.98%）、延伸链（14.62%）构成;（3）GrHDR蛋白序列与同属植物秦艽的HDR蛋白相似性最高（95.71%）;（4）实时荧光定量PCR结果显示GrHDR基因在滇龙胆中的表达量为根 > 叶 > 茎，而在10%、30%、100%全光光照条件下各组织的表达量有很大差异;（5）高效液相色谱法结果显示，不同光照条件下龙胆苦苷含量一致，均为根 > 叶 > 茎，其中100%全光光照下，药用部位根中龙胆苦苷含量达到7.141%，约是30%、10%全光光照条件的两倍，但该结果与同一光照条件下GrHDR基因表达规律不完全一致。该研究为阐述HDR基因功能及其与龙胆苦苷含量的关系提供参考。
关键词： 滇龙胆， GrHDR基因， 序列分析， 组织表达分析， 龙胆苦苷
中图分类号： Q943
文献标识码： A
文章编号： 1000-3142（2021）06-01004-10
收稿日期： 2020-03-10
基金项目： 国家自然科学基金（81760684）;中国科学院西双版纳热带植物园“一三五”重点培育项目（2017XTBG-F05） [Supported by the National Natural Science Foundation of China（81760684）; Xishuangbanna Tropical Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences “135 program” （2017XTBG-F05）]。
作者简介： 杜波（1994-），硕士，研究方向为药用植物栽培，（E-mail）dubo@xtbg.ac.cn。
*通信作者： 蔡传涛，研究员，博士研究生导师，研究方向为药用植物栽培，（E-mail） caict@xtbg.ac.cn。
Cloning and expression analysis of GrHDR gene in Gentiana rigescens
DU Bo1，2， CAI Chuantao1*， ZHANG Ji1，2，3
（ 1. Xishuangbanna Tropical Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Kunming 650221， China; 2. University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China; 3. Medicinal Plants Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming 650200， China ）
Abstract： Gentiopicroside， a derivative of terpenoids， is the main medicinal ingredient in traditional Chinese medicine “Long Dan”. 1-hydroxy-2-methyl-2-（E）-butenyl-4-diphosphate reductase （HDR） is a key enzyme in the synthesis of terpenoids. In order to explore the relationship between the expression of Gentiana rigescens HDR （GrHDR） gene and contents of gentiopicroside under different light conditions， the cDNA from the leaves of G. rigescens was used as template， the GrHDR gene sequence was obtained by PCR and TA cloning technologies， and then bioinformatics analysis and tissue expression analysis were carried out. Finally， high performance liquid chromatography （HPLC） was used to determine the contents of gentiopicroside， and the expression of GrHDR gene were compared to the contents of gentiopicroside. The results were as follows： （1） The GrHDR gene （GenBank accession number： KJ917165.1） was 1 398 bp in length and encodes 465 amino acids， its putative protein was hydrophilic and stable， the relative molecular mass was 52 281.25 Da， and the theoretical isoelectric point was 5.32. （2）The putative protein that belonged to the LYTB protein family may be located on the chloroplast and had no signal peptide， and its secondary structure was mainly composed of α-helix （45.16%）， β-turn （6.24%）， random coil （33.98%）， and extended chain （14.62%）. （3） The GrHDR protein sequence had the highest similarity to the HDR protein of the G. macrophylla （95.71%）. （4） The results of real-time PCR showed that the expression levels of GrHDR gene in G. rigescens were in the order of root > leaf > stem， its tissue expressions were significantly different under the condition of 10%， 30% and 100% of full-light. （5） The results of HPLC showed that the contents of gentiopicroside under different light conditions were in the order of root > leaf > stem; among them， the content of gentiopicroside in root （7.141%） under 100% of full light， which was about twice that of 30% and 10% of full light， but the results were not completely consistent with the GrHDR gene expression pattern under the same light condition. This study provides references for explaining the function of HDR gene and its relationship with gentiopicroside. 1.2.3 GrHDR基因的生物信息学分析 使用NCBI在线分析软件ORF finder将GrHDR基因翻译成蛋白质序列，并使用其他在线生物信息学工具预测和分析GrHDR蛋白质的理化性质、结构域、二级结构、信号肽、转运肽，亚细胞定位信号以及三维结构模型等，并使用DNAMAN 5.2.2软件进行序列比对，然后使用MEGA 6.0软件构建系统发育树。所用工具如表2所列。
1.2.4 不同组织中GrHDR基因的表达分析 分别取一年生滇龙胆的根、茎、叶，提取总RNA，反转录成cDNA作为qPCR的模板，采用GrGAPDH基因作为内参（张晓东等，2015），设计特异引物（表3），以2 × T5 Fast qPCR Mix（SYBR Green I，购自TSINGKE公司，生产批号：TSE202）进行扩增，反应条件：预变性阶段（95 ℃，1 min）;循环阶段（95 ℃，10 s;60 ℃，5 s;72 ℃，10 s）;溶解階段（95 ℃，15 s;60 ℃，1 min;95 ℃，15 s）;再循环阶段72 ℃采集荧光信号。采用比较CT值的“2-ΔΔCT”的方法进行定量数据的分析处理，结果用GraphPad Prism 5.0软件作图表示。
1.2.5 不同光照条件下GrHDR基因的组织表达分析 采用数字式照度计（型号：GM1040，购自深圳聚茂源科技有限公司）测得全光、一层及二层遮荫网下的对应光照强度为（107 248±7 938） lx，（31 196±3 406） lx，（10 217±804） lx，分别表示为100%、30%、10%全光光照，其他栽培措施保持一致，经过一年的光照处理，取滇龙胆植株的根、茎、叶，分别进行荧光定量PCR。具体方法及内参基因的选择参照1.2.4，进行GrHDR基因的组织表达分析。
1.3 龙胆苦苷含量的测定
1.3.1 试剂与仪器 对照品龙胆苦苷（批号：S2220010）购自上海安谱实验科技股份有限公司;甲醇为色谱纯， 其他试剂均为分析纯。所用仪器Agilent Technologies 1290 infinityⅡ高效液相色谱仪购自安捷伦科技（中国）有限公司、AS10200超声波清洗机购自天津奥特赛恩斯仪器有限公司等。
1.3.2 材料与前处理 将实验材料在50 ℃条件下烘干磨碎，过40目筛备用。首先，称取样品粉末0.25 g，置于50 mL 锥形瓶中，加入甲醇10 mL，称定质量;其次，在40 ℃条件下超声（300 w，40 kHz）提取30 min，冷却后继续称重，用甲醇补足减少的重量;然后，摇匀，取试液经0.22 μm微孔滤膜过滤后作为供试品。
1.3.3 龙胆苦苷HPLC检测的色谱条件 InertSustain C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），柱温为30 ℃，检测波长为241 nm，流速为1 mL·min-1，进样量为20 μL。流动相：流动相A相为甲醇，B相为0.1%甲酸水。梯度洗脱：0～15 min，7%～35%A;15～32 min，35%～90%A;36～42 min，10%～93%A。
2 结果与分析
2.1 GrHDR基因ORF序列的克隆
从幼叶提取总RNA后，使用分光光度计测得浓度为612.4 μg·mL-1，A260/280为1.82，纯度较高，置于-80 ℃冰箱中保存备用。反转录后，以滇龙胆叶片cDNA为模板，使用特异性引物并扩增出约1 500 bp的片段（图1）。通过TA克隆的方法获得质粒，酶切检测正确后，送至TSINGKE公司测序，表明GrHDR基因（GenBank登录号： KJ917165.1）ORF序列长1 398 bp，编码465个氨基酸。
2.2 GrHDR蛋白预测与分析
2.2.1 GrHDR蛋白的理化性质 使用ExPASy蛋白质组学服务器的Protparam分析GrHDR蛋白的理化性质，表4结果显示：该蛋白的不稳定系数为30.34，说明该蛋白是稳定的;分子质量为52 281.25 Da;理论等电点为5.32;脂肪系数是77.98;亲水性的平均值为-0.427，为亲水蛋白。
2.2.2 GrHDR蛋白的结构预测 利用SOPMA网站在线预测GrHDR蛋白的二级结构（图2），结果显示在GrHDR蛋白中，α-螺旋、β-转角、无规卷曲、延伸链的百分比分别为45.16%、6.24%、33.98%和14.62%。使用EMBL-EBI数据库中的pfam程序对GrHDR蛋白进行结构域预测，结果显示该蛋白属于LYTB[即1-hydroxy-2-methyl-2-（E）-butenyl-4-diphosphate reductase，HDR]蛋白家族。运用SignalP 5.0进行信号肽序列预测，结果显示GrHDR蛋白的信号肽的可能性为0.000 6，是非分泌蛋白。运用ChloroP 1.1 Server在线预测GrHDR蛋白转运肽长度，结果显示该蛋白含有转运肽序列为35个氨基酸残基。运用TMHMM 2.0server预测GrHDR蛋白序列的跨膜结构域，结果显示该蛋白无跨膜螺旋。运用Predict Protein预测GrHDR蛋白的亚细胞定位，结果显示该蛋白定位在叶绿体，可信度为71%;使用Softberry数据库ProtComp 9.0软件预测结果显示GrHDR蛋白亚细胞定位结果为叶绿体，结果得分为9.3;不同的预测工具预测结果是相同的。
2.2.3 三维结构的预测 运用SWISS-MODEL在线软件自动模式预测GrHDR蛋白的三级结构，所构建模型如图3所示。GMQE（全局模型质量估计）是一种质量估计，其值位于0～1之间，反映了使用该对齐和模板构建的模型预期准确度以及目标的覆盖范围，数字越接近1表示可靠性越高，该模型的GMQE值为0.42，可靠性一般。以超耐热菌Aquifex aeolicus 4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶（SMTL ID：3dnf.1）为模板，在第80位至第297位氨基酸处建模，序列相似度为36.86%。 2.3 多序列比对与系统发育分析
使用NCBI网站的BLASTp程序对GrHDR蛋白进行序列比对，结果表明滇龙胆GrHDR蛋白与同属植物秦艽（Gentiana macrophylla）GmHDR蛋白相似度最高（95.71%），其次是萝芙木（Rauvolfia verticillata）的RvHDR蛋白（84.09%），与长春花（Catharanthus roseus）、喜树（Camptotheca acuminata）、桂花（Osmanthus fragrans）、木樨榄（Olea europaea var. sylvestris）、黄猴花（Erythranthe guttata）、胡黄连（Picrorhiza kurrooa）等植物的HDR蛋白序列相似性也较高。运用DNAMAN对以上序列进行多序列比对，结果如图4所示。运用MEGA 6.0对以上序列与GrHDR蛋白序列进行系统发育分析，结果说明滇龙胆GrHDR蛋白与秦艽GmHDR蛋白位于同一分支，表明它们的亲缘关系最近（图5）。
2.4 滇龙胆GrHDR基因的组织特异性表达分析
取一年生滇龙胆的根、茎和叶，提取总RNA后，反转录成cDNA，通过qRT-PCR分析GrHDR基因在不同组织中的表达情况。结果表明GrHDR基因在根中的表达量最高，其次是叶和茎（图6）。
2.5 不同光照条件下GrHDR基因的组织特异性表达分析
在不同的光照条件下，GrHDR基因在不同组织中的表达量有很大差异（图7）。100%全光光照下，GrHDR基因的表达量为叶>茎>根，且叶中的表达量是根的2.59倍;在30%全光光照下，GrHDR基因的表达量为根>叶>茎，且叶中的表达量是根的0.70倍;在10%全光光照下，GrHDR基因的表达量为叶>根>茎，且叶中的表达量是根的2.75倍。结果表明，在30%全光光照下，GrHDR基因在作为药用部位的根的表达量最高。
2.6 龙胆苦苷含量分析
龙胆苦苷在0.001～0.500 mg·mL-1范围内线性关系良好，回归方程为y=24 960x+28.671（r=0.999 3）。根据公式计算求得对应龙胆苦苷含量，以质量分数表示，结果如图8所示。根及叶中龙胆苦苷含量多数大于1.5%，符合药典中关于滇龙胆龙胆苦苷含量的规定;此外，在不同光照条件下，龙胆苦苷含量均表现为根>叶>茎，与龙胆裂环烯醚萜类活性成分积累结果一致（赵志莲，2016）;在药用部位根中，100%全光光照时龙胆苦苷含量最多，达7.141%，分别是30%、10%全光光照条件下龙胆苦苷含量的2.25倍、2.26倍。
3 讨论与结论
MEP途径的流量决定了终产物的产量，酶反应的速率又决定了代谢途径的流量（张海晨等，2016）。尽管已在细菌和植物中鉴定了MEP途径的所有基因，但仍需大量工作来分析相应酶基因在控制中间体通量中的作用（Rodríguez-Concepción & Boronat，2002）。MEP途径的最后一步由HDR（以前称为LytB或IspH）催化，其将HMBPP转化为IPP或DMAPP，对萜类物质的合成具有重要的调控作用。过表达HDR基因会催化IPP和DMAPP以5∶1至6∶1的比例合成青蒿素（Peng et al.，2011）。HDR基因在喜树（Wang et al.，2008）、铁皮石斛（吴秋菊等，2015）等植物的不同组织中的表达量存在很大差异，且在同种植物不同组织中萜类代谢物的含量也存在类似差异（Wang et al.，2008）。
在本研究中， 我们从滇龙胆中克隆了GrHDR基因，并使用生物信息学方法对其编码蛋白进行了分析。结果表明，GrHDR基因的ORF长度为1 398 bp，编码465个氨基酸，属于LYTB蛋白家族成员; GrHDR蛋白定位于叶绿体，符合MEP途径定位于质体的事实。GrHDR蛋白序列与同属植物秦艽的相似度最高，且系统发育分析显示它们位于同一进化支。
遮荫会影响植物基因表达及次生代谢产物的积累，如不同遮荫处理下茶树中咖啡碱的含量呈现先下降后上升的趋势，而咖啡碱代谢途径中的关键基因（如TCS1）的表达呈现先升高后下降的趋势（顾辰辰等，2017）。本研究通过三种遮荫条件处理滇龙胆植株，使用荧光定量法测定GrHDR基因的表达量，并通过高效液相色谱仪测定龙胆苦苷含量。结果表明，GrHDR基因在滇龙胆的不同组织中均有表达，不同光照条件下该基因的表达有很大差异，且GrHDR基因表达规律与对应龙胆苦苷积累规律不完全一致。其中，图6的实验材料来自30%全光光照条件，其与图7中相同光照条件下的基因表达量都为根>叶>茎，但9月份的样品较5月份的样品表达量有所增加。由此可推測，不同光照时长会对GrHDR基因的表达量产生影响，进一步还可开展不同生长年限GrHDR基因表达量变化的研究。此外，不同光照条件下龙胆苦苷含量积累规律一致，但一层和二层遮荫下根的龙胆苦苷含量较低，因此可推测，滇龙胆苗期栽培时不需要遮荫。关于GrHDR基因表达与龙胆苦苷含量的具体关系，以100%全光光照条件为例，一年生植株龙胆苦苷含量积累为根>叶>茎，而对应GrHDR基因表达量为叶>茎>根。这一结果可能由于龙胆苦苷是在叶中合成，后通过茎运输至根中积累与储存（赵志莲，2016）。另外，龙胆苦苷合成途径包含一系列基因，仅通过GrHDR基因的表达无法得出其与龙胆苦苷含量之间的明确关系。
本研究对GrHDR基因进行了序列分析及表达量的分析，有助于在分子生物学水平上揭示龙胆苦苷的生物合成，为龙胆苦苷的代谢工程提供候选基因，且丰富了GrHDR基因的表达规律，并为以后GrHDR基因功能分析提供了参考。此外，通过不同光照条件下GrHDR的表达以及对应龙胆苦苷含量的研究，为滇龙胆栽培的生产实践提供了依据。下一步可通过过表达GrHDR基因及互补实验等深入研究该基因的功能，以及对该基因表达与龙胆苦苷含量之间的关系作进一步的探讨。 参考文献：
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（责任编辑 周翠鸣）
关键词： 滇龙胆， GrHDR基因， 序列分析， 组织表达分析， 龙胆苦苷
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收稿日期： 2020-03-10
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作者简介： 杜波（1994-），硕士，研究方向为药用植物栽培，（E-mail）dubo@xtbg.ac.cn。
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DU Bo1，2， CAI Chuantao1*， ZHANG Ji1，2，3
（ 1. Xishuangbanna Tropical Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Kunming 650221， China; 2. University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China; 3. Medicinal Plants Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming 650200， China ）
Abstract： Gentiopicroside， a derivative of terpenoids， is the main medicinal ingredient in traditional Chinese medicine “Long Dan”. 1-hydroxy-2-methyl-2-（E）-butenyl-4-diphosphate reductase （HDR） is a key enzyme in the synthesis of terpenoids. In order to explore the relationship between the expression of Gentiana rigescens HDR （GrHDR） gene and contents of gentiopicroside under different light conditions， the cDNA from the leaves of G. rigescens was used as template， the GrHDR gene sequence was obtained by PCR and TA cloning technologies， and then bioinformatics analysis and tissue expression analysis were carried out. Finally， high performance liquid chromatography （HPLC） was used to determine the contents of gentiopicroside， and the expression of GrHDR gene were compared to the contents of gentiopicroside. The results were as follows： （1） The GrHDR gene （GenBank accession number： KJ917165.1） was 1 398 bp in length and encodes 465 amino acids， its putative protein was hydrophilic and stable， the relative molecular mass was 52 281.25 Da， and the theoretical isoelectric point was 5.32. （2）The putative protein that belonged to the LYTB protein family may be located on the chloroplast and had no signal peptide， and its secondary structure was mainly composed of α-helix （45.16%）， β-turn （6.24%）， random coil （33.98%）， and extended chain （14.62%）. （3） The GrHDR protein sequence had the highest similarity to the HDR protein of the G. macrophylla （95.71%）. （4） The results of real-time PCR showed that the expression levels of GrHDR gene in G. rigescens were in the order of root > leaf > stem， its tissue expressions were significantly different under the condition of 10%， 30% and 100% of full-light. （5） The results of HPLC showed that the contents of gentiopicroside under different light conditions were in the order of root > leaf > stem; among them， the content of gentiopicroside in root （7.141%） under 100% of full light， which was about twice that of 30% and 10% of full light， but the results were not completely consistent with the GrHDR gene expression pattern under the same light condition. This study provides references for explaining the function of HDR gene and its relationship with gentiopicroside. 1.2.3 GrHDR基因的生物信息学分析 使用NCBI在线分析软件ORF finder将GrHDR基因翻译成蛋白质序列，并使用其他在线生物信息学工具预测和分析GrHDR蛋白质的理化性质、结构域、二级结构、信号肽、转运肽，亚细胞定位信号以及三维结构模型等，并使用DNAMAN 5.2.2软件进行序列比对，然后使用MEGA 6.0软件构建系统发育树。所用工具如表2所列。
1.2.4 不同组织中GrHDR基因的表达分析 分别取一年生滇龙胆的根、茎、叶，提取总RNA，反转录成cDNA作为qPCR的模板，采用GrGAPDH基因作为内参（张晓东等，2015），设计特异引物（表3），以2 × T5 Fast qPCR Mix（SYBR Green I，购自TSINGKE公司，生产批号：TSE202）进行扩增，反应条件：预变性阶段（95 ℃，1 min）;循环阶段（95 ℃，10 s;60 ℃，5 s;72 ℃，10 s）;溶解階段（95 ℃，15 s;60 ℃，1 min;95 ℃，15 s）;再循环阶段72 ℃采集荧光信号。采用比较CT值的“2-ΔΔCT”的方法进行定量数据的分析处理，结果用GraphPad Prism 5.0软件作图表示。
1.2.5 不同光照条件下GrHDR基因的组织表达分析 采用数字式照度计（型号：GM1040，购自深圳聚茂源科技有限公司）测得全光、一层及二层遮荫网下的对应光照强度为（107 248±7 938） lx，（31 196±3 406） lx，（10 217±804） lx，分别表示为100%、30%、10%全光光照，其他栽培措施保持一致，经过一年的光照处理，取滇龙胆植株的根、茎、叶，分别进行荧光定量PCR。具体方法及内参基因的选择参照1.2.4，进行GrHDR基因的组织表达分析。
1.3 龙胆苦苷含量的测定
1.3.1 试剂与仪器 对照品龙胆苦苷（批号：S2220010）购自上海安谱实验科技股份有限公司;甲醇为色谱纯， 其他试剂均为分析纯。所用仪器Agilent Technologies 1290 infinityⅡ高效液相色谱仪购自安捷伦科技（中国）有限公司、AS10200超声波清洗机购自天津奥特赛恩斯仪器有限公司等。
1.3.2 材料与前处理 将实验材料在50 ℃条件下烘干磨碎，过40目筛备用。首先，称取样品粉末0.25 g，置于50 mL 锥形瓶中，加入甲醇10 mL，称定质量;其次，在40 ℃条件下超声（300 w，40 kHz）提取30 min，冷却后继续称重，用甲醇补足减少的重量;然后，摇匀，取试液经0.22 μm微孔滤膜过滤后作为供试品。
1.3.3 龙胆苦苷HPLC检测的色谱条件 InertSustain C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），柱温为30 ℃，检测波长为241 nm，流速为1 mL·min-1，进样量为20 μL。流动相：流动相A相为甲醇，B相为0.1%甲酸水。梯度洗脱：0～15 min，7%～35%A;15～32 min，35%～90%A;36～42 min，10%～93%A。
2 结果与分析
2.1 GrHDR基因ORF序列的克隆
从幼叶提取总RNA后，使用分光光度计测得浓度为612.4 μg·mL-1，A260/280为1.82，纯度较高，置于-80 ℃冰箱中保存备用。反转录后，以滇龙胆叶片cDNA为模板，使用特异性引物并扩增出约1 500 bp的片段（图1）。通过TA克隆的方法获得质粒，酶切检测正确后，送至TSINGKE公司测序，表明GrHDR基因（GenBank登录号： KJ917165.1）ORF序列长1 398 bp，编码465个氨基酸。
2.2 GrHDR蛋白预测与分析
2.2.1 GrHDR蛋白的理化性质 使用ExPASy蛋白质组学服务器的Protparam分析GrHDR蛋白的理化性质，表4结果显示：该蛋白的不稳定系数为30.34，说明该蛋白是稳定的;分子质量为52 281.25 Da;理论等电点为5.32;脂肪系数是77.98;亲水性的平均值为-0.427，为亲水蛋白。
2.2.2 GrHDR蛋白的结构预测 利用SOPMA网站在线预测GrHDR蛋白的二级结构（图2），结果显示在GrHDR蛋白中，α-螺旋、β-转角、无规卷曲、延伸链的百分比分别为45.16%、6.24%、33.98%和14.62%。使用EMBL-EBI数据库中的pfam程序对GrHDR蛋白进行结构域预测，结果显示该蛋白属于LYTB[即1-hydroxy-2-methyl-2-（E）-butenyl-4-diphosphate reductase，HDR]蛋白家族。运用SignalP 5.0进行信号肽序列预测，结果显示GrHDR蛋白的信号肽的可能性为0.000 6，是非分泌蛋白。运用ChloroP 1.1 Server在线预测GrHDR蛋白转运肽长度，结果显示该蛋白含有转运肽序列为35个氨基酸残基。运用TMHMM 2.0server预测GrHDR蛋白序列的跨膜结构域，结果显示该蛋白无跨膜螺旋。运用Predict Protein预测GrHDR蛋白的亚细胞定位，结果显示该蛋白定位在叶绿体，可信度为71%;使用Softberry数据库ProtComp 9.0软件预测结果显示GrHDR蛋白亚细胞定位结果为叶绿体，结果得分为9.3;不同的预测工具预测结果是相同的。
2.2.3 三维结构的预测 运用SWISS-MODEL在线软件自动模式预测GrHDR蛋白的三级结构，所构建模型如图3所示。GMQE（全局模型质量估计）是一种质量估计，其值位于0～1之间，反映了使用该对齐和模板构建的模型预期准确度以及目标的覆盖范围，数字越接近1表示可靠性越高，该模型的GMQE值为0.42，可靠性一般。以超耐热菌Aquifex aeolicus 4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶（SMTL ID：3dnf.1）为模板，在第80位至第297位氨基酸处建模，序列相似度为36.86%。 2.3 多序列比对与系统发育分析
使用NCBI网站的BLASTp程序对GrHDR蛋白进行序列比对，结果表明滇龙胆GrHDR蛋白与同属植物秦艽（Gentiana macrophylla）GmHDR蛋白相似度最高（95.71%），其次是萝芙木（Rauvolfia verticillata）的RvHDR蛋白（84.09%），与长春花（Catharanthus roseus）、喜树（Camptotheca acuminata）、桂花（Osmanthus fragrans）、木樨榄（Olea europaea var. sylvestris）、黄猴花（Erythranthe guttata）、胡黄连（Picrorhiza kurrooa）等植物的HDR蛋白序列相似性也较高。运用DNAMAN对以上序列进行多序列比对，结果如图4所示。运用MEGA 6.0对以上序列与GrHDR蛋白序列进行系统发育分析，结果说明滇龙胆GrHDR蛋白与秦艽GmHDR蛋白位于同一分支，表明它们的亲缘关系最近（图5）。
2.4 滇龙胆GrHDR基因的组织特异性表达分析
取一年生滇龙胆的根、茎和叶，提取总RNA后，反转录成cDNA，通过qRT-PCR分析GrHDR基因在不同组织中的表达情况。结果表明GrHDR基因在根中的表达量最高，其次是叶和茎（图6）。
2.5 不同光照条件下GrHDR基因的组织特异性表达分析
在不同的光照条件下，GrHDR基因在不同组织中的表达量有很大差异（图7）。100%全光光照下，GrHDR基因的表达量为叶>茎>根，且叶中的表达量是根的2.59倍;在30%全光光照下，GrHDR基因的表达量为根>叶>茎，且叶中的表达量是根的0.70倍;在10%全光光照下，GrHDR基因的表达量为叶>根>茎，且叶中的表达量是根的2.75倍。结果表明，在30%全光光照下，GrHDR基因在作为药用部位的根的表达量最高。
2.6 龙胆苦苷含量分析
龙胆苦苷在0.001～0.500 mg·mL-1范围内线性关系良好，回归方程为y=24 960x+28.671（r=0.999 3）。根据公式计算求得对应龙胆苦苷含量，以质量分数表示，结果如图8所示。根及叶中龙胆苦苷含量多数大于1.5%，符合药典中关于滇龙胆龙胆苦苷含量的规定;此外，在不同光照条件下，龙胆苦苷含量均表现为根>叶>茎，与龙胆裂环烯醚萜类活性成分积累结果一致（赵志莲，2016）;在药用部位根中，100%全光光照时龙胆苦苷含量最多，达7.141%，分别是30%、10%全光光照条件下龙胆苦苷含量的2.25倍、2.26倍。
3 讨论与结论
MEP途径的流量决定了终产物的产量，酶反应的速率又决定了代谢途径的流量（张海晨等，2016）。尽管已在细菌和植物中鉴定了MEP途径的所有基因，但仍需大量工作来分析相应酶基因在控制中间体通量中的作用（Rodríguez-Concepción & Boronat，2002）。MEP途径的最后一步由HDR（以前称为LytB或IspH）催化，其将HMBPP转化为IPP或DMAPP，对萜类物质的合成具有重要的调控作用。过表达HDR基因会催化IPP和DMAPP以5∶1至6∶1的比例合成青蒿素（Peng et al.，2011）。HDR基因在喜树（Wang et al.，2008）、铁皮石斛（吴秋菊等，2015）等植物的不同组织中的表达量存在很大差异，且在同种植物不同组织中萜类代谢物的含量也存在类似差异（Wang et al.，2008）。
在本研究中， 我们从滇龙胆中克隆了GrHDR基因，并使用生物信息学方法对其编码蛋白进行了分析。结果表明，GrHDR基因的ORF长度为1 398 bp，编码465个氨基酸，属于LYTB蛋白家族成员; GrHDR蛋白定位于叶绿体，符合MEP途径定位于质体的事实。GrHDR蛋白序列与同属植物秦艽的相似度最高，且系统发育分析显示它们位于同一进化支。
遮荫会影响植物基因表达及次生代谢产物的积累，如不同遮荫处理下茶树中咖啡碱的含量呈现先下降后上升的趋势，而咖啡碱代谢途径中的关键基因（如TCS1）的表达呈现先升高后下降的趋势（顾辰辰等，2017）。本研究通过三种遮荫条件处理滇龙胆植株，使用荧光定量法测定GrHDR基因的表达量，并通过高效液相色谱仪测定龙胆苦苷含量。结果表明，GrHDR基因在滇龙胆的不同组织中均有表达，不同光照条件下该基因的表达有很大差异，且GrHDR基因表达规律与对应龙胆苦苷积累规律不完全一致。其中，图6的实验材料来自30%全光光照条件，其与图7中相同光照条件下的基因表达量都为根>叶>茎，但9月份的样品较5月份的样品表达量有所增加。由此可推測，不同光照时长会对GrHDR基因的表达量产生影响，进一步还可开展不同生长年限GrHDR基因表达量变化的研究。此外，不同光照条件下龙胆苦苷含量积累规律一致，但一层和二层遮荫下根的龙胆苦苷含量较低，因此可推测，滇龙胆苗期栽培时不需要遮荫。关于GrHDR基因表达与龙胆苦苷含量的具体关系，以100%全光光照条件为例，一年生植株龙胆苦苷含量积累为根>叶>茎，而对应GrHDR基因表达量为叶>茎>根。这一结果可能由于龙胆苦苷是在叶中合成，后通过茎运输至根中积累与储存（赵志莲，2016）。另外，龙胆苦苷合成途径包含一系列基因，仅通过GrHDR基因的表达无法得出其与龙胆苦苷含量之间的明确关系。
本研究对GrHDR基因进行了序列分析及表达量的分析，有助于在分子生物学水平上揭示龙胆苦苷的生物合成，为龙胆苦苷的代谢工程提供候选基因，且丰富了GrHDR基因的表达规律，并为以后GrHDR基因功能分析提供了参考。此外，通过不同光照条件下GrHDR的表达以及对应龙胆苦苷含量的研究，为滇龙胆栽培的生产实践提供了依据。下一步可通过过表达GrHDR基因及互补实验等深入研究该基因的功能，以及对该基因表达与龙胆苦苷含量之间的关系作进一步的探讨。 参考文献：
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（责任编辑 周翠鸣）