【摘 要】
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为建立一种准确、快速、敏感性更高的小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)检测方法,建立了一种芯片式数字PCR(cdPCR)检测方法.根据GenBank中公布的PPRV Nigeria75/1疫苗株N基因序列设计1对引物,PCR扩增大小为166 bp片段,构建pMDTM18-N标准质粒并优化反应条件,建立了PPRV N基因cdPCR检测方法,并与实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法的灵敏性、重复性、特异性和临床样品检测做了比较分析.结果显示:当质
【机 构】
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中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室/自然疫源性人畜共患病团队,黑龙江哈尔滨 150001;东北农业大学动物医学院,黑龙江哈尔滨 150030
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为建立一种准确、快速、敏感性更高的小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)检测方法,建立了一种芯片式数字PCR(cdPCR)检测方法.根据GenBank中公布的PPRV Nigeria75/1疫苗株N基因序列设计1对引物,PCR扩增大小为166 bp片段,构建pMDTM18-N标准质粒并优化反应条件,建立了PPRV N基因cdPCR检测方法,并与实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法的灵敏性、重复性、特异性和临床样品检测做了比较分析.结果显示:当质粒标准品浓度在1.22×(105～102)copies/μL范围时,cdPCR检测方法比普通RT-PCR灵敏度高1000倍,且稳定性好,特异性强;当标准品浓度在1.22×(105～10-3)copies/μL范围时,cdPCR与RT-qPCR相比具有相同的特异性,但灵敏性比RT-qPCR高100倍;与RT-qPCR测定结果(13.29±6.74)copies/μL相比,cdPCR的最低检测限更低,约为(0.44±0.14)copies/μL;cdPCR对47份临床样本的PPRV核酸阳性检出率(25.5％)高于RT-qPCR(17.0％).结果表明,建立的cdPCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为预防PPR早期流行提供了一种快速有效的诊断和定量检测方法.
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