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[摘 要]目的：开发重组抗HER2人源化单克隆抗体纯化工艺。方法：选择了亲和层析介质、阳离子层析介质、疏水层析介质作为备选介质进行纯化工艺开发。结果：确定纯化策略为依次Sure、SP-FF、Phenyl-HP层析。
[关键词]重组抗HER2人源化单克隆抗体 层析工艺
中图分类号：TQ2 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2014）22-0296-01
重组抗HER2人源化单克隆抗体（rhAnti-HER2）由人的IgGl框架区及能与HER2结合的鼠抗HER2抗体的互补决定区构成[1]。rhAnti-HER2在体外及动物实验中均显示可抑制HER2过度表达的肿瘤细胞的增殖。我们对rhAnti-HER2纯化工艺进行了研究。
1.仪器和材料
1.1 仪器
AKTA纯化系统、SORVALL离心机、亲和层析介质Sure、阳离子层析介质SP-FF、疏水层析介质Phenyl-HP
1.2 材料
rhAnti-HER2细胞培养丰收液（本研究所自产）、Tris（SIGMA）、HCl（西陇化工股份有限公司）、NaCl（天津博迪化工股份有限公司）、硫酸铵（天津市化学试剂三厂）
2.方法和结果
2.1 亲和层析工艺研究
由于rhAnti-HER2抗体的Fc段在中性溶液中可以和ProteinA特异结合，而丰收液中绝大部分杂质由于不能结合ProteinA而被去除，所以选择Sure作为第一步层析介质，可以在最大效率捕获目的蛋白的同时达到很好的纯化效果。
2.1.1 确定洗脱液pH值
细胞丰收液澄清后上样，上样量保持一致，洗脱液pH值调为3.1、3.2、3.3、3.4分别进行洗脱，根据收率及纯度结果确定洗脱pH值。结果洗脱量分别为18、18、17、16mg；A280/A260分别为1.61、1.58、1.59、1.61；HPLC纯度分别为92.8%、92.5%、93.5%、95.0%。pH3.1-pH3.4洗脱量逐渐降低，A280/A260比值逐渐增加，蛋白纯度无明显差异，因此确定洗脱液pH值为3.1-3.3。
2.1.2 确定上样液pH值
细胞丰收液澄清后，分别调pH值为6.5、7.0、7.5、8.0，上样量恒定，保留时间5min，洗脱pH3.3，考察收率及纯度确定上样液的pH值。结果收率分别为95.5%、96.5%、97.0%、97.0%；HPLC纯度分别为93.1%、95.8%、94.2%、93.0%。结果显示，pH6.5收率及纯度均较低，pH8.0纯度较低，所以选定上样液pH值为7.0-7.5。
2.2 离子交换层析工艺研究
离子层析为常用的层析方法，分离效果好，效率高。我们选用SP-FF阳离子交换层析凝胶进行后续纯化，此步骤可进一步去除残留杂质。
2.2.1 保留時间及动态载量
层析pH4.5，0.35mol/LNaCl洗脱。保留时间分别为1、2、5min，其它条件不变，确定动态载量并根据动态载量来确定上样保留时间。结果收率分别为82.4%、85.7%、82.9%；动态载量分别为31、52、79mg/ml。结果显示，各保留时间下，回收率均大于85%，，动态载量随保留时间增加而增加，最后趋于平稳，因此选择保留时间大于5min，此时动态载量为79mg/ml。
2.2.2 确定上样液pH值
亲和层析样品分别调pH值为4.0、4.5、5.0，进行SP层析，保留时间5min，0.4mol/LNaCl洗脱。考察收率及纯度，确定上样液pH值。结果收率分别为80.4%、88.4%、86.9%。pH4.0上样收率最低，pH4.5收率最高，而且pH5.0时样品的电导率较高，载量受限，因此上样pH选择pH4.5。
2.2.3 预洗及洗脱盐浓度的确定
层析pH=4.5，保留时间5min，0-0.5mol/LNaCl盐浓度梯度洗脱，根据各段收集样品的纯度及杂质去除情况确定预洗及洗脱盐浓度。结果见（表1）。
结果显示，样品主要集中在峰2收集部分。各项指标均优于峰前，因此选择预洗盐浓度为0.2mol/L，对应电导率约22mS/cm，洗脱盐浓度为0.35mol/L，对应电导率约34mS/cm。
2.3 疏水层析工艺研究
使用Phenyl-HP介质进行后续纯化，此步骤可进一步去除残留杂质。
2.3.1 确定上样盐浓度
分别将CM-FF洗脱样品添加硫酸铵至0.5M、1M，pH4.5上样，保留时间5min。考察不同盐浓度时的动态载量。结果上样量分别为288mg、922mg；收率分别为81.3%、91.2%；HPLC纯度分别为96.1%、96.3%。结果显示，提高上样盐浓度，上样量、收率会随之提高，洗脱质量不变。而1M硫酸铵已接近蛋白对硫酸铵的最大可耐受浓度（颗粒析出），因此选择1M硫酸铵上样。
2.3.2 确定洗脱pH
保留时间5min，洗脱液pH值分别为5.5、6.5、7.5。根据收率及纯度来确定洗脱pH值。结果收率分别为84.4%、87.3%、88.4%；HPLC纯度分别为96.7%、96.7%、96.1%；CHO细胞蛋白残留量分别为0.005%、0.008%、0.018%。收率随洗脱pH增加而增加。HPLC纯度变化不显著，pH6.5杂质残留量较低，因此选定洗脱pH为6.5。
3.讨论
我们利用国际上抗体纯化通用亲和层析最为第一步层析，结果第一步纯化后就获得了较高纯度的目的蛋白，通过SP-FF、Phenyl-HP后续纯化进一步将提高纯度，同时降低杂质残留量，使纯度及杂质满足药物开发要求。通过实验成功开发了重组抗HER2人源化单克隆抗体纯化工艺。
参考文献
[1] Cianfroca M，Goldstein LJ. Prognostic and predictive factors in early-stage breast cancer[J].Oncologist，2004，9：606-616.
[关键词]重组抗HER2人源化单克隆抗体 层析工艺
中图分类号：TQ2 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2014）22-0296-01
重组抗HER2人源化单克隆抗体（rhAnti-HER2）由人的IgGl框架区及能与HER2结合的鼠抗HER2抗体的互补决定区构成[1]。rhAnti-HER2在体外及动物实验中均显示可抑制HER2过度表达的肿瘤细胞的增殖。我们对rhAnti-HER2纯化工艺进行了研究。
1.仪器和材料
1.1 仪器
AKTA纯化系统、SORVALL离心机、亲和层析介质Sure、阳离子层析介质SP-FF、疏水层析介质Phenyl-HP
1.2 材料
rhAnti-HER2细胞培养丰收液（本研究所自产）、Tris（SIGMA）、HCl（西陇化工股份有限公司）、NaCl（天津博迪化工股份有限公司）、硫酸铵（天津市化学试剂三厂）
2.方法和结果
2.1 亲和层析工艺研究
由于rhAnti-HER2抗体的Fc段在中性溶液中可以和ProteinA特异结合，而丰收液中绝大部分杂质由于不能结合ProteinA而被去除，所以选择Sure作为第一步层析介质，可以在最大效率捕获目的蛋白的同时达到很好的纯化效果。
2.1.1 确定洗脱液pH值
细胞丰收液澄清后上样，上样量保持一致，洗脱液pH值调为3.1、3.2、3.3、3.4分别进行洗脱，根据收率及纯度结果确定洗脱pH值。结果洗脱量分别为18、18、17、16mg；A280/A260分别为1.61、1.58、1.59、1.61；HPLC纯度分别为92.8%、92.5%、93.5%、95.0%。pH3.1-pH3.4洗脱量逐渐降低，A280/A260比值逐渐增加，蛋白纯度无明显差异，因此确定洗脱液pH值为3.1-3.3。
2.1.2 确定上样液pH值
细胞丰收液澄清后，分别调pH值为6.5、7.0、7.5、8.0，上样量恒定，保留时间5min，洗脱pH3.3，考察收率及纯度确定上样液的pH值。结果收率分别为95.5%、96.5%、97.0%、97.0%；HPLC纯度分别为93.1%、95.8%、94.2%、93.0%。结果显示，pH6.5收率及纯度均较低，pH8.0纯度较低，所以选定上样液pH值为7.0-7.5。
2.2 离子交换层析工艺研究
离子层析为常用的层析方法，分离效果好，效率高。我们选用SP-FF阳离子交换层析凝胶进行后续纯化，此步骤可进一步去除残留杂质。
2.2.1 保留時间及动态载量
层析pH4.5，0.35mol/LNaCl洗脱。保留时间分别为1、2、5min，其它条件不变，确定动态载量并根据动态载量来确定上样保留时间。结果收率分别为82.4%、85.7%、82.9%；动态载量分别为31、52、79mg/ml。结果显示，各保留时间下，回收率均大于85%，，动态载量随保留时间增加而增加，最后趋于平稳，因此选择保留时间大于5min，此时动态载量为79mg/ml。
2.2.2 确定上样液pH值
亲和层析样品分别调pH值为4.0、4.5、5.0，进行SP层析，保留时间5min，0.4mol/LNaCl洗脱。考察收率及纯度，确定上样液pH值。结果收率分别为80.4%、88.4%、86.9%。pH4.0上样收率最低，pH4.5收率最高，而且pH5.0时样品的电导率较高，载量受限，因此上样pH选择pH4.5。
2.2.3 预洗及洗脱盐浓度的确定
层析pH=4.5，保留时间5min，0-0.5mol/LNaCl盐浓度梯度洗脱，根据各段收集样品的纯度及杂质去除情况确定预洗及洗脱盐浓度。结果见（表1）。
结果显示，样品主要集中在峰2收集部分。各项指标均优于峰前，因此选择预洗盐浓度为0.2mol/L，对应电导率约22mS/cm，洗脱盐浓度为0.35mol/L，对应电导率约34mS/cm。
2.3 疏水层析工艺研究
使用Phenyl-HP介质进行后续纯化，此步骤可进一步去除残留杂质。
2.3.1 确定上样盐浓度
分别将CM-FF洗脱样品添加硫酸铵至0.5M、1M，pH4.5上样，保留时间5min。考察不同盐浓度时的动态载量。结果上样量分别为288mg、922mg；收率分别为81.3%、91.2%；HPLC纯度分别为96.1%、96.3%。结果显示，提高上样盐浓度，上样量、收率会随之提高，洗脱质量不变。而1M硫酸铵已接近蛋白对硫酸铵的最大可耐受浓度（颗粒析出），因此选择1M硫酸铵上样。
2.3.2 确定洗脱pH
保留时间5min，洗脱液pH值分别为5.5、6.5、7.5。根据收率及纯度来确定洗脱pH值。结果收率分别为84.4%、87.3%、88.4%；HPLC纯度分别为96.7%、96.7%、96.1%；CHO细胞蛋白残留量分别为0.005%、0.008%、0.018%。收率随洗脱pH增加而增加。HPLC纯度变化不显著，pH6.5杂质残留量较低，因此选定洗脱pH为6.5。
3.讨论
我们利用国际上抗体纯化通用亲和层析最为第一步层析，结果第一步纯化后就获得了较高纯度的目的蛋白，通过SP-FF、Phenyl-HP后续纯化进一步将提高纯度，同时降低杂质残留量，使纯度及杂质满足药物开发要求。通过实验成功开发了重组抗HER2人源化单克隆抗体纯化工艺。
参考文献
[1] Cianfroca M，Goldstein LJ. Prognostic and predictive factors in early-stage breast cancer[J].Oncologist，2004，9：606-616.