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一、实验原理
细胞培养是用无菌操作的方法，将动物体内的组织取出，模拟体内的生理条件，在体外进行培养。培养过程分为原代培养和传代培养。原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞，组织和器官，用无菌操作的方法，经销化，分散成为单个游离的细胞。在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。传代培养是指细胞自从一个培养瓶以1：2比例转移，接种到另一培养瓶的培养。
这次实验我所用的抗生素瓶和小玻璃珠便用于细胞的传代培养。本来这次实验用小玻璃珠，这种模式融汇了扩大贴壁面积和便于观察的优点，并且重演性好。
二、材料
（一）实验动物
乳鼠10只，体质量7～8g，刚出生三天，保持室温20℃～25℃;
（二）实验器材
空的抗生素瓶 玻璃珠 眼科剪 眼科镊 试管 吸管等
（三）实验试剂
磷酸缓冲液（PBS）;平衡盐液：Hank原液 Hank液;细胞消化液：0.5%胰蛋白酶和0.4%EDTA钠盐液。以上溶液经包装，灭菌后备用
三、实验步骤
（一）试剂的配制
1.Hank原液与Hank液的配制
配制程序：
（1）称取1.4g Hank原液，溶于30～50ml的蒸馏水中。
（2）取1000ml烧杯及容量瓶各一个，先放蒸馏水800ml于烧杯中，然后逐一称取药品，但必须在前一药品溶解后，方可加入下一药品，充分混匀后，分装，盖紧瓶盖，写好标签，置于4°C冰箱保存。
2.胰蛋白溶液的配制
3.0.02%的EDTA鈉盐溶液的配制
4.水解乳蛋白—Hank液的配制
5.E-MEM营养液的配制
6.104U/ml青霉素、链霉素的配制
（二）实验营养液的配制
1.原代细胞营养液的配制
2.传代细胞营养液的配制
（三）培养器皿
1.玻璃漏斗式滤器
玻璃漏斗式滤器将滤板与玻璃漏斗烧结成一体，适用于各种培养用液的过滤除菌，但不宜血清等粘稠液体。
2.手术器械
主要用于解剖动物，取材和原代培养中切割组织。各种器械至少需配置两套
3.培养瓶
用于原代培养的需要卡氏瓶10～15瓶，而传代培养需用12～25个卡氏瓶，另准备5瓶抗生素瓶，每次用完后，清洗时一定要彻底，以防下次用时污染。
4.其他器皿
无论是烧杯量筒还是锥形瓶等，每种至少要准备四个以上，用于配药，装废液等
（四）肝细胞的培养过程
1.原代细胞的培养过程
（1）操作者首先进行手的清洗与消毒，在实验台上放置一个酒精灯，并用酒精擦拭实验台，将小鼠放置实验台上，解剖前用酒精棉擦拭鼠体。
（2）取材
①用镊子将乳鼠的脊柱夹短
②用解剖刀切开腹部，找寻乳鼠肝脏，为三瓣、半个手指大小
③用弯头眼科镊取出肝脏，置于注有Hank液的小烧杯中
（3）剪碎
用眼科剪将肝脏剪碎，尽量细致地剪，大约1mm2大小的块，大小尽量均匀一致，然后用Hank液洗涤2～3次，直到液体澄清为止。
（4）消化及分散组织块
将上步清洗的Hank液吸掉，加入0.25%胰蛋白液。置于37°C水浴中进行消化，消化时间在20～30min左右。每隔十分钟摇动一次小烧杯（其中最好放几粒玻璃珠），以便组织块散开，以便继续消化，直到组织块变成松散、粘稠状，并且，颜色略微变为白色为止。放在离心机中离心，吸去上清液，用吸管反复吹打组织块，直到散成混淆的细胞悬液为止。
（5）计数及稀释
从上步的细胞悬液中吸取1ml细胞液，进行计数。将细胞液滴于血细胞计数板上，按白细胞计数法进行计数，计数后用营养液进行稀释。
（6）分装及培养
将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中（一般为5ml/卡氏瓶），盖上瓶盖，切勿太紧，以免不透气。在培养瓶上做好标签，注明细胞，及日期，然后置于37oC，5%浓度CO2的CO2培养箱中进行培养。
（7）观察：每日进行观察
四、结果与分析
（一）结果
原代第一次实验
总结：这次接种后细胞的贴壁生长原代培养宣告失败，失败的原因有以下几种可能：
①培养液配制的浓度不够，导致培养液失效
②接种浓度不够，因为一只乳鼠共接种了30瓶，之后又没有计数，很可能是浓度不够
③胰蛋白酶的活性弱
其中，②、③步的可能性最大，应予以注意。
本次实验唯一的成功之处就是灭菌情况良好，污染率为0
原代第二次实验：
总结：第二次实验镜检，虽然细胞已贴壁，但仍有未完全消化的细胞团，说明胰蛋白酶的消化还是效果不佳，虽然我已经延长了消化时间，但还是不理想;
第一次传代培养实验：
总结：虽然细胞长势正常，但是细胞数目少，而且未连成片，可能是培养的时间短，或者是在进行传代接种时细胞流失过多所致;
第二次传代培养实验：
总结：细胞长势较上一次良好，抗生素小瓶中仍不好观察，但能模糊看到细胞有贴壁生长，数量还是很多，所以，本次仿效微载体的方案成功，但较微载体偏少。
（二）分析
照片中所呈现的圆球形颗粒就是细胞，大部分细胞连接成片，个别细胞形状不规则，有的还可观察到细胞分裂，从原代细胞和传代细胞的比较中，可看到传代培养的细胞体积较原代的要小，密度也小，这可能是我们所提供的细胞生长环境还没有完全达到标准，还有就是一些操作中的问题。
辽宁省海城市南台高级中学 李维维
细胞培养是用无菌操作的方法，将动物体内的组织取出，模拟体内的生理条件，在体外进行培养。培养过程分为原代培养和传代培养。原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞，组织和器官，用无菌操作的方法，经销化，分散成为单个游离的细胞。在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。传代培养是指细胞自从一个培养瓶以1：2比例转移，接种到另一培养瓶的培养。
这次实验我所用的抗生素瓶和小玻璃珠便用于细胞的传代培养。本来这次实验用小玻璃珠，这种模式融汇了扩大贴壁面积和便于观察的优点，并且重演性好。
二、材料
（一）实验动物
乳鼠10只，体质量7～8g，刚出生三天，保持室温20℃～25℃;
（二）实验器材
空的抗生素瓶 玻璃珠 眼科剪 眼科镊 试管 吸管等
（三）实验试剂
磷酸缓冲液（PBS）;平衡盐液：Hank原液 Hank液;细胞消化液：0.5%胰蛋白酶和0.4%EDTA钠盐液。以上溶液经包装，灭菌后备用
三、实验步骤
（一）试剂的配制
1.Hank原液与Hank液的配制
配制程序：
（1）称取1.4g Hank原液，溶于30～50ml的蒸馏水中。
（2）取1000ml烧杯及容量瓶各一个，先放蒸馏水800ml于烧杯中，然后逐一称取药品，但必须在前一药品溶解后，方可加入下一药品，充分混匀后，分装，盖紧瓶盖，写好标签，置于4°C冰箱保存。
2.胰蛋白溶液的配制
3.0.02%的EDTA鈉盐溶液的配制
4.水解乳蛋白—Hank液的配制
5.E-MEM营养液的配制
6.104U/ml青霉素、链霉素的配制
（二）实验营养液的配制
1.原代细胞营养液的配制
2.传代细胞营养液的配制
（三）培养器皿
1.玻璃漏斗式滤器
玻璃漏斗式滤器将滤板与玻璃漏斗烧结成一体，适用于各种培养用液的过滤除菌，但不宜血清等粘稠液体。
2.手术器械
主要用于解剖动物，取材和原代培养中切割组织。各种器械至少需配置两套
3.培养瓶
用于原代培养的需要卡氏瓶10～15瓶，而传代培养需用12～25个卡氏瓶，另准备5瓶抗生素瓶，每次用完后，清洗时一定要彻底，以防下次用时污染。
4.其他器皿
无论是烧杯量筒还是锥形瓶等，每种至少要准备四个以上，用于配药，装废液等
（四）肝细胞的培养过程
1.原代细胞的培养过程
（1）操作者首先进行手的清洗与消毒，在实验台上放置一个酒精灯，并用酒精擦拭实验台，将小鼠放置实验台上，解剖前用酒精棉擦拭鼠体。
（2）取材
①用镊子将乳鼠的脊柱夹短
②用解剖刀切开腹部，找寻乳鼠肝脏，为三瓣、半个手指大小
③用弯头眼科镊取出肝脏，置于注有Hank液的小烧杯中
（3）剪碎
用眼科剪将肝脏剪碎，尽量细致地剪，大约1mm2大小的块，大小尽量均匀一致，然后用Hank液洗涤2～3次，直到液体澄清为止。
（4）消化及分散组织块
将上步清洗的Hank液吸掉，加入0.25%胰蛋白液。置于37°C水浴中进行消化，消化时间在20～30min左右。每隔十分钟摇动一次小烧杯（其中最好放几粒玻璃珠），以便组织块散开，以便继续消化，直到组织块变成松散、粘稠状，并且，颜色略微变为白色为止。放在离心机中离心，吸去上清液，用吸管反复吹打组织块，直到散成混淆的细胞悬液为止。
（5）计数及稀释
从上步的细胞悬液中吸取1ml细胞液，进行计数。将细胞液滴于血细胞计数板上，按白细胞计数法进行计数，计数后用营养液进行稀释。
（6）分装及培养
将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中（一般为5ml/卡氏瓶），盖上瓶盖，切勿太紧，以免不透气。在培养瓶上做好标签，注明细胞，及日期，然后置于37oC，5%浓度CO2的CO2培养箱中进行培养。
（7）观察：每日进行观察
四、结果与分析
（一）结果
原代第一次实验
总结：这次接种后细胞的贴壁生长原代培养宣告失败，失败的原因有以下几种可能：
①培养液配制的浓度不够，导致培养液失效
②接种浓度不够，因为一只乳鼠共接种了30瓶，之后又没有计数，很可能是浓度不够
③胰蛋白酶的活性弱
其中，②、③步的可能性最大，应予以注意。
本次实验唯一的成功之处就是灭菌情况良好，污染率为0
原代第二次实验：
总结：第二次实验镜检，虽然细胞已贴壁，但仍有未完全消化的细胞团，说明胰蛋白酶的消化还是效果不佳，虽然我已经延长了消化时间，但还是不理想;
第一次传代培养实验：
总结：虽然细胞长势正常，但是细胞数目少，而且未连成片，可能是培养的时间短，或者是在进行传代接种时细胞流失过多所致;
第二次传代培养实验：
总结：细胞长势较上一次良好，抗生素小瓶中仍不好观察，但能模糊看到细胞有贴壁生长，数量还是很多，所以，本次仿效微载体的方案成功，但较微载体偏少。
（二）分析
照片中所呈现的圆球形颗粒就是细胞，大部分细胞连接成片，个别细胞形状不规则，有的还可观察到细胞分裂，从原代细胞和传代细胞的比较中，可看到传代培养的细胞体积较原代的要小，密度也小，这可能是我们所提供的细胞生长环境还没有完全达到标准，还有就是一些操作中的问题。
辽宁省海城市南台高级中学 李维维