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目的构建一种可以同时靶向抑制人类表皮生长因子受体2(HER2)和表皮生长因子受体(EGFR)分子的双特异性单链抗体,从而降低单一通路抑制而造成的耐药性,增强抗肿瘤效果。方法采用Overlap PCR法通过柔性肽(G4S)将曲妥珠单抗的可变区与西妥昔单抗连接,构建工程载体,并通过大肠埃希菌系统进行表达纯化,获得同时靶向HER2和EGFR的双特异性单链抗体;流式细胞术检测双特异性单链抗体对EGFR和HER2过表达的乳腺癌细胞BT474的结合能力;噻唑蓝(MTT)法检测单链抗体对BT474乳腺癌细胞的增殖抑制;建立BT474荷瘤小鼠动物模型,检测双特异性单链抗体的体内抗肿瘤活性;使用免疫组织化学检测单链抗体是否可以抑制表皮生长因子受体(EGFR)的磷酸化,并对肿瘤细胞增殖指标Ki-67进行检测。结果通过基因工程手段和毕赤酵母表达及镍柱纯化,成功获得双特异性单链抗体,经蛋白印迹法鉴定验证了双特异性单链抗体表达及装配正确。流式细胞术检测双特异性单链抗体与乳腺癌细胞BT474的结合率为53.3%,与曲妥珠单抗(69.0%)、西妥昔单抗结合率(60.3%)相当。MTT法中,与磷酸盐缓冲液(PBS)组相比,曲妥珠单抗组、西妥昔单抗组与双特异性单链抗体组对乳腺癌细胞BT474均有抑制作用,且抑制作用呈浓度依赖性。在蛋白水平为400nmol/L时,双特异性单链抗体组抑制率[(65.19±4.21)%]强于曲妥珠单抗组[(40.67±1.78)%]与西妥昔单抗组[(32.20±2.94)%]。通过裸鼠移植瘤模型的体内抗肿瘤实验,双特异性单链抗体组在体内仍能发挥较强的抗肿瘤效果,高剂量组肿瘤抑制率可以达到(74.32±4.37)%,明显优于曲妥珠单抗组(44.83±6.02)%与西妥昔单抗组(39.44±8.75)%。通过免疫组织化学对给药后的肿瘤组织进行分析,与PBS组相比,双特异性单链抗组可以明显抑制BT474皮下移植瘤组织中p-EGFR、Ki-67的表达量。结论采用毕赤酵母表达体系成功构建并表达了双特异性单链抗体。双特异性单链抗体具有良好的体内外抗肿瘤活性,有效抑制乳腺癌细胞BT474的体内外增殖,并通过免疫组织化学分析到双特异性单链抗体可以抑制EGFR的磷酸化并抑制肿瘤细胞的增殖,为抗肿瘤治疗提供了新的思路,有潜在的临床应用前景。