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摘 要：利用Plackett-Burman（PB）设计对芽孢杆菌GUTU06的固态发酵培养基的主要培养基组分及培养条件进行筛选，旨在提高GUTU06所产β-葡萄糖苷酶的酶活力，并将其应用于水解银杏黄酮苷为苷元。结果表明蛋白胨和发酵时间为主要影响因子。在PB设计的基础上，获得了初步优化的培养条件，优化后β-葡萄糖苷酶的酶活力为0.9914 U/g，较初始培养基提高了3.8倍。本文为β-葡萄糖苷酶实现工业化生产奠定基础，同时也为酶法水解银杏黄酮苷的研究提供一定参考依据。
关键词：Plackett-Burman（PB）设计; 主要因子; 芽孢杆菌; β-葡萄糖苷酶 ;银杏黄酮苷
中图分类号：TQ925
文献标识码：A
文章编号：1008-0457（2021）02-0080-04
国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.02.014
Abstract：The main medium components and culture conditions of the solid fermentation medium of Bacillus sp.GUTU06 were screened by Plackett-Burman （PB） design to improve the enzyme activity of β-glucosidase，which is produced by GUTU06 and applied to hydrolyze ginkgo flavonoid glycosides into aglycones.The results of the experiment determined that peptone and fermentation time were the main influencing factors.On the basis of PB design，the initial optimized culture conditions were obtained.After optimization，the enzyme activity of β-glucosidase was 0.9914 U/g，which was 3.8 times higher than that of the initial medium.This paper lays a foundation for the industrial production of β-glucosidase，and also provides a reference for the study of enzymatic hydrolysis of ginkgo flavonoid glycosides.
Keywords：Plackett-Burman （PB） design; main factor;Bacillus;β-glucosidase; ginkgo flavonoid
銀杏叶（Ginkgo biloba L.）提取物是目前国际上使用较为广泛的中草药之一，主要药效成分是黄酮类化合物[1]。银杏黄酮占银杏叶提取物总含量的22%～24%[2-3]，其主要由山奈酚、槲皮素以及异鼠李素等黄酮苷元与葡萄糖等单糖以O-糖苷键连接而成。黄酮类化合物在生物体内代谢时，仅有占比很小的苷元型黄酮可以直接被肠道吸收进入血液发挥作用，而占比很大的糖苷型黄酮则无法实现[4-6]。故水解银杏黄酮为苷元极具现实意义[7]。
目前，水解银杏黄酮主要有化学法和生物法。化学法又细分为碱法和酸法，由于通过碱法所得的苷元不稳定、易分解，故酸法较碱法应用更为广泛;生物法即酶法，其较酸法具有条件温和、稳定性好、活性成分保留完整等优点，故酶法较酸法发展前景更加良好。水解酶的选择范围广泛，因β-葡萄糖苷酶具有水解效果良好、测定方法简便、应用范围普遍、理论研究清晰等特点[8-9]，故优先选择β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶来源广泛，酵母菌[10]、霉菌[11]、肠道细菌[12]、芽孢杆菌[13]等均可产。
本实验室前期已从贵州传统发酵豆制品中筛选产β-葡萄糖苷酶的功能微生物芽孢杆菌GUTU06，此研究计划通过PB设计筛选该菌主要培养基成分及培养条件，为进一步提高其产β-葡萄糖苷酶的能力奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料与仪器
1.1.1 菌株
解淀粉芽孢杆菌GUTU06菌株由本实验室分离，现已保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M 201923。
1.1.2 培养基
种子培养基：酵母提取物5 g/L、牛肉膏10 g/L、氯化钠5 g/L。
1.1.3 种子培养
从菌株GUTUO6活化斜面上挑取2环接种到250 mL锥形瓶中（含150 mL种子培养基），37 ℃，180 r/min培养24 h，制得种子液。
1.1.4 醋酸—醋酸钠缓冲液配制
准确吸取2.4 mL冰醋酸（冰乙酸）至烧杯，添加适量蒸馏水，再加入4.92 g无水醋酸钠，溶解，定容至1000 mL，调节pH至4.80±0.01后使用。室温下存放2个月有效。
1.1.5 1%银杏黄酮苷溶液
准确称取1 g银杏黄酮苷于烧杯中，加0.05 mol/L、pH 4.8醋酸—醋酸钠缓冲液溶解70 mL，待溶解完全后转入容量瓶并继续使用该缓冲液定容至100 mL，最后置于冰箱中备用。
1.1.6 黄豆前处理及黄豆固态发酵后粗酶液的制备
准确称量高质量黄豆，加入8倍体积的去离子水，常温浸泡18 h，沥水后备用。称50 g湿豆于250 mL三角瓶，添加一定量的碳源、氮源、无机盐混匀，121 ℃灭菌20 min。冷却后接种子液摇匀，37 ℃发酵，每12 h摇晃一次。培养结束后取出，于4 ℃冰箱后熟12 h即得豆豉。 称取10 g后熟后的豆豉，加入20 mL的无菌生理盐水中，4 ℃条件下浸提24 h，后用打浆机捣碎经12000 r/min离心10 min，上清液即为固态发酵粗酶液。
1.1.7 β-葡萄糖苷酶活力的测定
以银杏黄酮苷为底物，在测定条件下，将每分钟水解银杏黄酮苷产生1 μmol葡萄糖所需酶量定义为1个酶活力单位，用U/g表示。
测定原理：DNS试剂里的3，5-二硝基水杨酸分子中的硝基可被葡萄糖还原成3-胺基-5-硝基水杨酸（呈橙黄色）[14]。吸光值大小体现溶液橙黄色强度，溶液橙黄色强度展现葡萄糖量多少，而葡萄糖量表示酶活力高低，故可通过吸光值大小反映酶活力高低。
葡萄糖标准曲线的绘制：吸取1 mg/mL葡萄糖溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于具塞刻度试管中，补水至2 mL，加DNS试剂3 mL，混合后于沸水中煮10 min，冷却后加水定容至15 mL，于波长540 nm处测吸光度值。以吸光度值（y）为纵坐标，葡萄糖质量浓度（x）为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线[7]：y=0.4643x-0.0151，R2=0.9961。
酶活力测定方法：取15 mL具塞刻度试管加入底物（含银杏黄酮苷溶液）1.8 mL，50 ℃预热3 min，加入粗酶液0.2 mL，50 ℃水浴30 min，加入DNS试剂3 mL，沸水浴10 min，冷却至室温，定容至15 mL。以灭活的酶液为空白对照，于波长540 nm处测定吸光度值。根据葡萄糖标准溶液回归方程计算粗酶液中葡萄糖质量浓度[7]。
1.2 发酵培养基成分及培养条件的 Plackett-Burman试验
在豆豉发酵的单因素预试验中，合适的碳源，氮源和无机盐及接种量、发酵时间、发酵温度是果糖，糊精，蛋白胨，氯化钾 ，接种量8%，发酵时间5 d，发酵温度34 ℃对β-葡萄糖苷酶的酶活有明显的正面影响。因此，它们被选为PB设计的媒介组合。对于PB设计，在两个级别（级别+1和级别-1，如表1所示）中評估七个变量和四个虚拟变量。根据PB设计，表1中显示了培养基的成分浓度，此阶段试验设计、数据分析及模型建立由Design-Expert软件8.06（Stat-Ease，Inc.，Minneapolis，USA）进行[15]。
1.3 数据分析
各项指标重复测定至少3次，取其平均值，通过Design-Expert 8.06和SPSS 21.0分析数据。
2 结果与分析
应用基于统计学的试验设计来优化培养基是研究几种因素的影响和提高产量的有效方法。PB统计试验设计是两级因子设计的一部分，允许用至少“n”个试验[11]研究“n-1”变量，这对于发现影响因素的重要性非常有用[16]。
因此，以果糖、糊精、蛋白胨、氯化钾、接种量、发酵时间、发酵温度为考查对象，按照Plackett-Burman设计进行了12次试验（表 2）。表2结果的方差分析如表3所示。
对试验结果进行方差分析表明，蛋白胨（X2）、发酵时间（X8）对β-葡萄糖苷酶酶活有显著影响（P<0.05），其他5个因素的影响不显著（P>0.05）不进入模型。此模型P<0.05，说明合适。因此，在忽略了不重要的条件（P>0.05）后，用一个修正的一阶方程用编码因子描述了β-葡萄糖苷酶酶活，由试验数据拟合得到的模型方程为 ：
Y=0.733+0.074X2+0.07X8（1）
（1）式表明蛋白胨浓度和发酵时间对β-葡萄糖苷酶酶活有影响，即高浓度的蛋白胨可以提高β-葡萄糖苷酶酶活。这可能是由于蛋白胨中含有促进产酶的营养成分;同时，较长的发酵时间也能提高β-葡萄糖苷酶酶活。同时根据（1）式可得，经优化后β-葡萄糖苷酶酶活的理论值可以达到0.87 U/g。
根据他和PB设计，优化培养基应有：X2、X8取高水平，其他因素水平取低水平，用优化的培养基在30 ℃培养，做6组平行试验。结果如表4所示。
所得β-葡萄糖苷酶酶活为0.9914 U/g（表4），高于预测值0.87 U/g。基本符合预测的优化结果。表明PB设计的试验结果是可信的，根据前期试验已知基础培养基酶活为：0.2601 U/g。因此，通过PB试验设计，β-葡萄糖苷酶的酶活提高了3.8倍。
PB试验结果也表明PB试验是寻找影响微生物培养的主要影响因素的有效手段。陈志杰等[17]也利用PB 设计在灵芝生长及产胞外多糖主要影响因子为蔗糖 、磷酸二氢钾、和硫酸锌;李翠琴等[15]通过PB设计发现影响黑曲霉GZUF36产脂肪酶培养的主要因子为葡萄糖，豆饼粉和氯化钾，通过PB设计其产脂肪酶活力提高了0.78倍。本试验也取得了良好结果，为后续的进一步如何提高解淀粉芽孢杆菌GUTU06产水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶的酶活力试验指明了方向和奠定基础。
3 结论与讨论
本试验通过PB设计寻找影响产水解银杏黄酮苷的新菌株解淀粉芽孢杆菌GUTU06的产酶培养的主要因素，以提高其β-葡萄糖苷酶的活力。评价指标是β-葡萄糖苷酶水解银杏黄酮苷的能力。研究了4种培养基成分和3种培养条件的作用，发现蛋白胨和发酵时间是影响解淀粉芽孢杆菌GUTU06β-葡萄糖苷酶的活力的重要因素。在此基础上获得了初步优化的培养条件，其中提高后β-葡萄糖苷酶的活力为0.9914 U/g。与使用初始培养基相比，β-葡萄糖苷酶的活力增加了3.8倍。该研究为使用响应面优化技术进一步优化β-葡萄糖苷酶和产业化应用此酶水解银杏黄酮苷制备银杏黄酮苷元奠定了基础。
参 考 文 献：
[1] 吴竹，王秋萍，田漫漫，等.银杏不同部位黄酮、内酯和银杏酸含量分析[J].山地农业生物学报，2017，36（4）：72-75. [2] 苗建英.銀杏叶中黄酮类化合物提取工艺研究[J].中成药，2006，28（7）：1060-1061.
[3] SINGH B，KAUR P，GOPICHAND，et al.Biology and chemistry of Ginkgo biloba[J].Fitoterapia，2008，79（6）：401-418.
[4] 蔡健.黄酮提取工艺研究进展[J].淮阴工学院学报，2003，25（5）：82-85.
[5] 吴鹏，郭峰，陈龙，等.银杏叶黄酮的酶法提取及生物转化研究[J].特产研究，2007（4）：22-24.
[6] 吴超，苏红利，张晓鸣.银杏叶提取物制取黄酮苷元的酶解工艺研究[J].食品与机械，2005，21（6）：27-30.
[7] 朱啟会，高泽鑫，何腊平，等.产水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶菌株的筛选及鉴定[J].中国酿造，2017，36（9）：102-106.
[8] 刘宏丽，郭晓军，狄聪颖，等.产β-葡萄糖苷酶芽孢杆菌的筛选及水解大豆异黄酮糖苷研究[J].河北大学学报（自然科学版），2017，37（6）：621-629.
[9] 杨浣漪，崔美林，金成日，等.灰树花发酵产β-葡萄糖苷酶和胞内多糖培养基及条件优化[J].中国食品学报，2017，12（5）：142-146.
[10] 王佳，胡兰兰，张军翔，等.高产β-葡萄糖苷酶野生酵母的筛选及产酶能力差异性分析[J].中国酿造，2018，37（2）：50-53.
[11] BHJRIF，CHAABOUNJSE，LJMAMF，et al.Purification and biochemical characterization of extracellular β-glucosidases from the hypercellulolytic Pol6 mutant of Penicillium occitanis[J].Applied Biochemistry Biotechnology，2008，149（2）：169-182.
[12] 李笑梅，马慧玲.两株素食者肠道菌产β-葡萄糖苷酶考察及产酶条件优化[J].食品科学，2016，37（7）：123-127.
[13] 于平，李鹏.产中性耐热β-葡萄糖苷酶芽袍杆菌的筛选与鉴定测定[J].中国食品学报，2017，17（9）：236-42.
[14] HAIPING S，XIAOGANG WU，XIAODANG W，et al.Screening of β-glucanase-producing microorganisms and medium optimization for β-glucanase production[J].China Brewing，2011，22（6）：67-71.
[15] CUIQIN LI，CS X，LAPING HE，et al.Application of Plackett-Burman Design to Find Main Medium Components and Improve Yield of Diglyceride Synthesizedby A.niger GZUF36 Lipase[J].Journal of Pure and Applied Microbiology，2014，8（5）：3519-3523.
[16] PEDRESCHI F，KAACK K，GRANBY K.The effect of asparaginase on acrylamide formation in French fries[J].Food Chemistry，2008，109（2）：386-392.
[17] 陈志杰，韩永斌，沈昌，等.Plackett-Burman设计在灵芝生长及产胞外多糖主要影响因子筛选中的应用[J].食品科学，2005，26（12）：115-118.
关键词：Plackett-Burman（PB）设计; 主要因子; 芽孢杆菌; β-葡萄糖苷酶 ;银杏黄酮苷
中图分类号：TQ925
文献标识码：A
文章编号：1008-0457（2021）02-0080-04
国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.02.014
Abstract：The main medium components and culture conditions of the solid fermentation medium of Bacillus sp.GUTU06 were screened by Plackett-Burman （PB） design to improve the enzyme activity of β-glucosidase，which is produced by GUTU06 and applied to hydrolyze ginkgo flavonoid glycosides into aglycones.The results of the experiment determined that peptone and fermentation time were the main influencing factors.On the basis of PB design，the initial optimized culture conditions were obtained.After optimization，the enzyme activity of β-glucosidase was 0.9914 U/g，which was 3.8 times higher than that of the initial medium.This paper lays a foundation for the industrial production of β-glucosidase，and also provides a reference for the study of enzymatic hydrolysis of ginkgo flavonoid glycosides.
Keywords：Plackett-Burman （PB） design; main factor;Bacillus;β-glucosidase; ginkgo flavonoid
銀杏叶（Ginkgo biloba L.）提取物是目前国际上使用较为广泛的中草药之一，主要药效成分是黄酮类化合物[1]。银杏黄酮占银杏叶提取物总含量的22%～24%[2-3]，其主要由山奈酚、槲皮素以及异鼠李素等黄酮苷元与葡萄糖等单糖以O-糖苷键连接而成。黄酮类化合物在生物体内代谢时，仅有占比很小的苷元型黄酮可以直接被肠道吸收进入血液发挥作用，而占比很大的糖苷型黄酮则无法实现[4-6]。故水解银杏黄酮为苷元极具现实意义[7]。
目前，水解银杏黄酮主要有化学法和生物法。化学法又细分为碱法和酸法，由于通过碱法所得的苷元不稳定、易分解，故酸法较碱法应用更为广泛;生物法即酶法，其较酸法具有条件温和、稳定性好、活性成分保留完整等优点，故酶法较酸法发展前景更加良好。水解酶的选择范围广泛，因β-葡萄糖苷酶具有水解效果良好、测定方法简便、应用范围普遍、理论研究清晰等特点[8-9]，故优先选择β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶来源广泛，酵母菌[10]、霉菌[11]、肠道细菌[12]、芽孢杆菌[13]等均可产。
本实验室前期已从贵州传统发酵豆制品中筛选产β-葡萄糖苷酶的功能微生物芽孢杆菌GUTU06，此研究计划通过PB设计筛选该菌主要培养基成分及培养条件，为进一步提高其产β-葡萄糖苷酶的能力奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料与仪器
1.1.1 菌株
解淀粉芽孢杆菌GUTU06菌株由本实验室分离，现已保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M 201923。
1.1.2 培养基
种子培养基：酵母提取物5 g/L、牛肉膏10 g/L、氯化钠5 g/L。
1.1.3 种子培养
从菌株GUTUO6活化斜面上挑取2环接种到250 mL锥形瓶中（含150 mL种子培养基），37 ℃，180 r/min培养24 h，制得种子液。
1.1.4 醋酸—醋酸钠缓冲液配制
准确吸取2.4 mL冰醋酸（冰乙酸）至烧杯，添加适量蒸馏水，再加入4.92 g无水醋酸钠，溶解，定容至1000 mL，调节pH至4.80±0.01后使用。室温下存放2个月有效。
1.1.5 1%银杏黄酮苷溶液
准确称取1 g银杏黄酮苷于烧杯中，加0.05 mol/L、pH 4.8醋酸—醋酸钠缓冲液溶解70 mL，待溶解完全后转入容量瓶并继续使用该缓冲液定容至100 mL，最后置于冰箱中备用。
1.1.6 黄豆前处理及黄豆固态发酵后粗酶液的制备
准确称量高质量黄豆，加入8倍体积的去离子水，常温浸泡18 h，沥水后备用。称50 g湿豆于250 mL三角瓶，添加一定量的碳源、氮源、无机盐混匀，121 ℃灭菌20 min。冷却后接种子液摇匀，37 ℃发酵，每12 h摇晃一次。培养结束后取出，于4 ℃冰箱后熟12 h即得豆豉。 称取10 g后熟后的豆豉，加入20 mL的无菌生理盐水中，4 ℃条件下浸提24 h，后用打浆机捣碎经12000 r/min离心10 min，上清液即为固态发酵粗酶液。
1.1.7 β-葡萄糖苷酶活力的测定
以银杏黄酮苷为底物，在测定条件下，将每分钟水解银杏黄酮苷产生1 μmol葡萄糖所需酶量定义为1个酶活力单位，用U/g表示。
测定原理：DNS试剂里的3，5-二硝基水杨酸分子中的硝基可被葡萄糖还原成3-胺基-5-硝基水杨酸（呈橙黄色）[14]。吸光值大小体现溶液橙黄色强度，溶液橙黄色强度展现葡萄糖量多少，而葡萄糖量表示酶活力高低，故可通过吸光值大小反映酶活力高低。
葡萄糖标准曲线的绘制：吸取1 mg/mL葡萄糖溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于具塞刻度试管中，补水至2 mL，加DNS试剂3 mL，混合后于沸水中煮10 min，冷却后加水定容至15 mL，于波长540 nm处测吸光度值。以吸光度值（y）为纵坐标，葡萄糖质量浓度（x）为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线[7]：y=0.4643x-0.0151，R2=0.9961。
酶活力测定方法：取15 mL具塞刻度试管加入底物（含银杏黄酮苷溶液）1.8 mL，50 ℃预热3 min，加入粗酶液0.2 mL，50 ℃水浴30 min，加入DNS试剂3 mL，沸水浴10 min，冷却至室温，定容至15 mL。以灭活的酶液为空白对照，于波长540 nm处测定吸光度值。根据葡萄糖标准溶液回归方程计算粗酶液中葡萄糖质量浓度[7]。
1.2 发酵培养基成分及培养条件的 Plackett-Burman试验
在豆豉发酵的单因素预试验中，合适的碳源，氮源和无机盐及接种量、发酵时间、发酵温度是果糖，糊精，蛋白胨，氯化钾 ，接种量8%，发酵时间5 d，发酵温度34 ℃对β-葡萄糖苷酶的酶活有明显的正面影响。因此，它们被选为PB设计的媒介组合。对于PB设计，在两个级别（级别+1和级别-1，如表1所示）中評估七个变量和四个虚拟变量。根据PB设计，表1中显示了培养基的成分浓度，此阶段试验设计、数据分析及模型建立由Design-Expert软件8.06（Stat-Ease，Inc.，Minneapolis，USA）进行[15]。
1.3 数据分析
各项指标重复测定至少3次，取其平均值，通过Design-Expert 8.06和SPSS 21.0分析数据。
2 结果与分析
应用基于统计学的试验设计来优化培养基是研究几种因素的影响和提高产量的有效方法。PB统计试验设计是两级因子设计的一部分，允许用至少“n”个试验[11]研究“n-1”变量，这对于发现影响因素的重要性非常有用[16]。
因此，以果糖、糊精、蛋白胨、氯化钾、接种量、发酵时间、发酵温度为考查对象，按照Plackett-Burman设计进行了12次试验（表 2）。表2结果的方差分析如表3所示。
对试验结果进行方差分析表明，蛋白胨（X2）、发酵时间（X8）对β-葡萄糖苷酶酶活有显著影响（P<0.05），其他5个因素的影响不显著（P>0.05）不进入模型。此模型P<0.05，说明合适。因此，在忽略了不重要的条件（P>0.05）后，用一个修正的一阶方程用编码因子描述了β-葡萄糖苷酶酶活，由试验数据拟合得到的模型方程为 ：
Y=0.733+0.074X2+0.07X8（1）
（1）式表明蛋白胨浓度和发酵时间对β-葡萄糖苷酶酶活有影响，即高浓度的蛋白胨可以提高β-葡萄糖苷酶酶活。这可能是由于蛋白胨中含有促进产酶的营养成分;同时，较长的发酵时间也能提高β-葡萄糖苷酶酶活。同时根据（1）式可得，经优化后β-葡萄糖苷酶酶活的理论值可以达到0.87 U/g。
根据他和PB设计，优化培养基应有：X2、X8取高水平，其他因素水平取低水平，用优化的培养基在30 ℃培养，做6组平行试验。结果如表4所示。
所得β-葡萄糖苷酶酶活为0.9914 U/g（表4），高于预测值0.87 U/g。基本符合预测的优化结果。表明PB设计的试验结果是可信的，根据前期试验已知基础培养基酶活为：0.2601 U/g。因此，通过PB试验设计，β-葡萄糖苷酶的酶活提高了3.8倍。
PB试验结果也表明PB试验是寻找影响微生物培养的主要影响因素的有效手段。陈志杰等[17]也利用PB 设计在灵芝生长及产胞外多糖主要影响因子为蔗糖 、磷酸二氢钾、和硫酸锌;李翠琴等[15]通过PB设计发现影响黑曲霉GZUF36产脂肪酶培养的主要因子为葡萄糖，豆饼粉和氯化钾，通过PB设计其产脂肪酶活力提高了0.78倍。本试验也取得了良好结果，为后续的进一步如何提高解淀粉芽孢杆菌GUTU06产水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶的酶活力试验指明了方向和奠定基础。
3 结论与讨论
本试验通过PB设计寻找影响产水解银杏黄酮苷的新菌株解淀粉芽孢杆菌GUTU06的产酶培养的主要因素，以提高其β-葡萄糖苷酶的活力。评价指标是β-葡萄糖苷酶水解银杏黄酮苷的能力。研究了4种培养基成分和3种培养条件的作用，发现蛋白胨和发酵时间是影响解淀粉芽孢杆菌GUTU06β-葡萄糖苷酶的活力的重要因素。在此基础上获得了初步优化的培养条件，其中提高后β-葡萄糖苷酶的活力为0.9914 U/g。与使用初始培养基相比，β-葡萄糖苷酶的活力增加了3.8倍。该研究为使用响应面优化技术进一步优化β-葡萄糖苷酶和产业化应用此酶水解银杏黄酮苷制备银杏黄酮苷元奠定了基础。
参 考 文 献：
[1] 吴竹，王秋萍，田漫漫，等.银杏不同部位黄酮、内酯和银杏酸含量分析[J].山地农业生物学报，2017，36（4）：72-75. [2] 苗建英.銀杏叶中黄酮类化合物提取工艺研究[J].中成药，2006，28（7）：1060-1061.
[3] SINGH B，KAUR P，GOPICHAND，et al.Biology and chemistry of Ginkgo biloba[J].Fitoterapia，2008，79（6）：401-418.
[4] 蔡健.黄酮提取工艺研究进展[J].淮阴工学院学报，2003，25（5）：82-85.
[5] 吴鹏，郭峰，陈龙，等.银杏叶黄酮的酶法提取及生物转化研究[J].特产研究，2007（4）：22-24.
[6] 吴超，苏红利，张晓鸣.银杏叶提取物制取黄酮苷元的酶解工艺研究[J].食品与机械，2005，21（6）：27-30.
[7] 朱啟会，高泽鑫，何腊平，等.产水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶菌株的筛选及鉴定[J].中国酿造，2017，36（9）：102-106.
[8] 刘宏丽，郭晓军，狄聪颖，等.产β-葡萄糖苷酶芽孢杆菌的筛选及水解大豆异黄酮糖苷研究[J].河北大学学报（自然科学版），2017，37（6）：621-629.
[9] 杨浣漪，崔美林，金成日，等.灰树花发酵产β-葡萄糖苷酶和胞内多糖培养基及条件优化[J].中国食品学报，2017，12（5）：142-146.
[10] 王佳，胡兰兰，张军翔，等.高产β-葡萄糖苷酶野生酵母的筛选及产酶能力差异性分析[J].中国酿造，2018，37（2）：50-53.
[11] BHJRIF，CHAABOUNJSE，LJMAMF，et al.Purification and biochemical characterization of extracellular β-glucosidases from the hypercellulolytic Pol6 mutant of Penicillium occitanis[J].Applied Biochemistry Biotechnology，2008，149（2）：169-182.
[12] 李笑梅，马慧玲.两株素食者肠道菌产β-葡萄糖苷酶考察及产酶条件优化[J].食品科学，2016，37（7）：123-127.
[13] 于平，李鹏.产中性耐热β-葡萄糖苷酶芽袍杆菌的筛选与鉴定测定[J].中国食品学报，2017，17（9）：236-42.
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