以产苦马豆素内生真菌Undifilum oxytropis NX‐FEL001为供试菌株，研究了培养方式、菌龄、酶解时间和酶解温度等，对U ．oxytropis原生质体制备和再生的影响。结果表明，U ．oxytropis菌丝在质量分数为10 g／L纤维素酶＋10 g／L蜗牛酶＋1 g／L溶壁酶组成的复合酶溶液，35℃恒温，80 r／min振荡孵育3 h左右，原生质体释放量最高；原生质体在Y C M 培养基上，22℃培养9 d可以再生形成菌落，培养15 d其再生率可达8．5％；原生质体在YCM 培养基上再生后其菌落颜色与野生型U ．oxytropis不一致，呈现白色；菌丝形态与野生型U ．oxytropis相一致，经检测再生后菌丝仍然能够产生苦马豆素。U ．oxytropis原生质体的制备，将为进行疯草内生真菌的遗传转化和基因操作研究提供重要工具，为进一步开展疯草内生真菌合成苦马豆素的分子调控机制奠定基础。