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摘 要： 柿单宁是一种重要的食品功能成分，广泛应用于食品、医疗等领域，研究柿单宁的生物生产特性对其产业应用具有重要意义。该研究以广西特色涩柿品种‘恭城月柿’为材料，测定了幼果期、膨大期、成熟前期、成熟期和成熟后期柿果肉、果皮和叶片的可溶性单宁含量，并利用液质联用色谱对全部样品中6种单宁组分 [没食子酸（GA）、没食子儿茶素（GC）、儿茶素（CA）、芦丁（Rutin）、表没食子儿茶素（EGC）和表儿茶素（EC）]进行了定量分析。结果表明：柿果肉和果皮中含有丰富的可溶性单宁，在膨大期含量最高，分別达到21.93 mg·g-1和18.41 mg·g-1，随着果实进入成熟阶段显著下降;柿叶片的可溶性单宁含量较低，并且在整个生育期内无明显变化。另外，在柿果肉中检测到GA、GC和CA 3种单宁组分，其中GA含量显著高于其他组分;在柿果皮中检测到GA、GC、CA、Rutin和EGC 5种组分，其中CA含量最高，EGC仅在幼果期和膨大期有痕量检出;在柿叶中检测到全部6种单宁组分，其中整个生育期CA含量极高，EGC和EC均为痕量检出。由此可知，幼果期至膨大期的柿果实可产出较多可溶性单宁，其中果肉中含有较多的GA组分，果皮中含有大量的CA组分，柿叶片在整个生育期均可产出极为丰富的CA单宁组分。该研究为柿单宁的功能性开发利用提供基础数据。
关键词： 柿， 生育期， 单宁， 组分， 液相色谱质谱联用
中图分类号： Q945
文献标识码： A
文章编号： 1000-3142（2020）05-0735-09
Changes of tannin component content in persimmon fruits and leaves at different growth and development periods
LU Di1， HUANG Sijie1， LONG Minghua1， SUN Ningjing2*
（ 1. College of Agriculture， Guangxi University， Nanning 530004， China; 2. College of Resources and Environment Sciences， Baoshan University， Baoshan 678000， Yunnan， China ）
Abstract： Persimmon tannin is an important food functional component， which is widely used in food industry， medicine and other fields. Therefore， the study on persimmon tannin biological production pattern has its significance to the industry application. ‘Gongcheng’ persimmon is the unique cultivar in Guangxi， this cultivar is a typical astringent type which means it has high level tannin content. In the present study， took ‘Gongcheng’ persimmon was taken as experiment material， to reveal the changes of soluble tannin component content in fruits and leaves at the growth and development periods. Soluble tannin contents in the flesh， peels and leaves of persimmon fruits at young period， expansion period， early mature period， mature period and late mature period were determined. Six tannin components such as gallic acid （GA）， gallocatechin （GC）， catechin （CA）， rutin （Rutin）， epigallocatechin （EGC） and epigallocatechin （EC） in all samples were quantitatively analyzed by LC-MS. The results were as follows： Soluble tannin were rich in persimmon flesh and skin， and the content was the highest in the expansion period， reaching 21.93 and 18.41 mg·g-1， then decreased significantly as fruit matured. The soluble tannin content in persimmon leaves was low， and there was no significant changes during the whole growth period. In addition， three tannin components like GA， GC and CA were detected in persimmon flesh， while GA content was significantly higher than other components. Five components such as GA， GC， CA， Rutin and EGC were detected in persimmon peels， while the content of CA was the highest， and EGC only had trace detection at young and expansion periods. All six tannin components were detected in persimmon leaves， among which CA content was markedly high during the whole growth period， however both EGC and EC were just detected in trace amounts. Therefore， more soluble tannin production would be found in persimmon fruits from young period to expansion period， the flesh contains a great quantity of GA and the peel contains a large amount of CA component. Persimmon leaves could produce abundant CA component in the whole growth period. Key words： persimmon， growth and development periods， tannin， component， LC-MS
柿树属于柿科（Ebenaceae）柿属（Diospyros L.）多年生落叶果树，已有1 000多年的栽培历史（Naval et al.， 2010）。柿果实中含有丰富的糖、酸、维生素、胡萝卜素等营养成分，既可鲜食，也可加工成柿饼、饮品等（顾海峰，2007）。国内外研究报道，柿叶中含有的多酚类、黄酮类、萜类、香豆素类和甾醇类等多种生理活性物质（任飞，2011;杨琼琼等，2016），具有抗癌、抗衰老、调节免疫等多种药理作用（王燕，2008）。此外，柿含有丰富的单宁类物质，高出普通水果十几倍甚至几十倍。单宁是决定果实涩味的主要因子（Sugiura， 1984），具有抗氧化（罗正荣和张青林，2009）、抑菌（董晓倩，2014）、缓解蛇毒（徐淑芬等，2011）、清肺止咳（Itamura et al.， 2011）、吸附重金属（罗正荣和张青林，2009）等功效。
柿单宁是植物多酚的一种，根据其溶解程度，分为可溶性单宁和不可溶性单宁。可溶性单宁是决定柿果实涩味的主要物质。可溶性单宁可用无水甲醇提取，不可溶性单宁不溶于无水甲醇，而溶于甲醇的水溶液，当提取条件改变时不可溶性单宁可转变为可溶性单宁（胡耀星和谢笔钧，1991;Taira， 1998）。
柿单宁不同于其他水果单宁，具有独特的结构特征（Li et al.， 2010）。早在1923年，Komats和Mutsua就对柿单宁分子进行了研究，从柿果实提出多酚类物质，并把这种物质命名为“柿子素” （张宝善和陈绵屏，1997）。其后，Matsuo & Ito（1978）采用NMR的手段鉴定其结构，并提出其主要的组成结构分子为4种儿茶素类（Flavanpentol）单体——表儿茶素（EC）、表儿茶素没食子酸（ECG）、表没食子酸酸儿茶素（EGC）和表没食子酸儿茶素没食子酸（EGCG），组成比例为1∶1∶2∶2，并推测出其分子量约为13 000。前人研究发现，200 g的涩柿约含有80 g儿茶素类，且仅为EC和EGCG，其余则为3 g的可溶性单宁（Salvador et al.， 2007）。
柿单宁分子结构多样且复杂，目前对柿单宁的研究主要集中在初步提纯并验证其抗氧化活性方面，对其组成成分的分析和其他功能性的开发较少。因此本研究以广西主栽的特色涩柿品种‘恭城月柿’为材料，研究其不同生育期果实和叶片中可溶性单宁及其单宁组分含量的变化规律，为后續功能性开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂和仪器
供试材料：广西大学植物标本园栽植的‘恭城月柿’品种，分别采摘于5个时期：幼果期（2017年8月9日）、膨大期（2017年8月31日）、成熟前期（2017年9月30日）、成熟期（2017年10月28日）和成熟后期（2017年11月19日）。选取大小均匀、成熟度一致、无病虫害且无机械损伤的果实和柿叶，分3个生物学重复测定其单果重、硬度及总色差，同时分离果肉和果皮，液氮冷冻后保存于-40 ℃，以备后续定量分析。
试剂：乙腈，质谱纯（Fisher Chemical公司）;标准品：儿茶素（CA）、表儿茶素（EC）、没食子酸（GA）、没食子儿茶素（GC）、表没食子儿茶素（EGC）、芦丁（Rutin），含量≥95%（北京索莱宝科技有限公司）;其他试剂均为国产分析纯。
仪器设备：质构仪TA.XT.Plus（英国，Stable Micro System公司）;超高效液相色谱—四级杆串联飞行时间质谱仪（UPLC-QTOF）（配有可变波长紫外检测器 ADC 和数据采集与分析软件 Masslynx 4.1 工作站，美国Waters公司）;旋转蒸发仪;分析天平;离心机。
1.2 实验方法
1.2.1 单果重、硬度、总色差的测定 每个时期果实分3个生物学重复，每个生物学重复随机取10个果实，用百分之一天平称量，记录单果重并计算平均值。
硬度的测定选取质构仪TA.XT.Plus（英国，Stable Micro Systems公司）对果实硬度进行测定，分别选取柿果实赤道上相反方向的两个面，削去果皮，采用直径为5 mm的圆柱形探头进行穿刺测定。
总色差的测定采用CR-10色差计对果实色差进行测定（日本，KONICA MINOLTA公司），记录L、a、b值，计算总色差ΔE值。计算公式：ΔE=（ΔL）2+（Δa）2+（Δb）2。其中，设幼果期的L、a、b值为标准值，其他时期的L、a、b值为测定值，测定值与标准值之差即为ΔL、Δa、Δb值。
1.2.2 可溶性单宁的测定 可溶性单宁的测定参照Taira（1996）的方法并做部分改良。取5 g果肉（果皮、柿叶）加入80%的甲醇25 mL，室温下放置10 min，期间摇动3次，于温度为4 ℃，转速为9 500 r·s-1条件下离心20 min，重复提取两次，合并提取液，用80%的甲醇定容至100 mL。样液稀释至1 000 mL，先取稀释后的待测样液1 mL，加入6 mL蒸馏水;摇匀后加入0.5 mL 1 N的福林酚试剂，摇匀，静置3 min;然后加入1 mL饱和Na2CO3溶液和1.5 mL的蒸馏水，摇匀;最后，避光条件下静置1 h，于725 nm处测定吸光值。
1.2.3 单宁组分测定 样品制备：提取方法同1.2.2方法，将粗提液浓缩至10 mL，取1 mL于 0. 22 μm 微孔滤膜过滤后装入2 mL进样瓶备用。
色谱条件：色谱柱Waters Acquity-BCH C18（100 mm ×2.1 mm，0.18 μm），流速0. 2 mL·min-1，柱温30 ℃，二极管阵列检测器（ADC）检测波长280 nm，进样量2 μL，梯度洗脱条件见表 1。 质谱条件：采用电离子喷雾（ESI）法。毛细管电压2.5 kV，锥孔电压30 V，扫描范围50～1 200 Da，离子源温度100 ℃，脱溶剂温度350 ℃，锥孔气流量50 L·h-1，脱溶剂气流量700 L·h-1。
标准溶液的配置：称取GC、EC、EGC、GA、CA、Rutin各1.0 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成标准混合样品储备液。使用前将混合母液用甲醇分别稀释成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg·mL-1等不同浓度的混合标样，分别取1 mL于0.22 μm微孔滤膜过滤后装入2 mL进样瓶备用。
1.3 统计分析
采用SPSS 17.0软件的单因素方差分析方法对数据进行统计分析，并利用Excel 2007进行数据处理及制图。
2 结果与分析
2.1 柿不同时期单果重、硬度、总色差变化规律
由图1：A可知，随着柿果实的生长发育，单果重整体呈显著上升趋势。具体地，单果重从幼果期到膨大期上升幅度最大，上升了30.47 g;膨大期到成熟前期增幅最小，仅上升了9.86 g，说明从幼果期到膨大期果实发育迅速，膨大期到成熟前期发育缓慢。
由图1：B可知，柿果实的硬度呈明显下降趋势，其中从成熟前期到成熟期果实的硬度下降最为显著，降低了11.46 N。
由图1：C可知， 随着果实的成熟，总色差ΔE值显著上升，其中成熟前期到成熟期增幅最大，增长了8.7，说明此时果实转色成熟。
2.2 柿不同时期不同部位可溶性单宁含量的变化
由图2可知，柿果肉和果皮中可溶性单宁含量均在膨大期最高，分别为21.93、18.41 mg·g-1，進入成熟阶段后，可溶性单宁含量显著下降，于成熟后期降至最低，分别为11.27、2.47 mg·g-1;各时期柿叶中的可溶性单宁含量在5.51～9.43 mg·g-1之间波动，相对于柿果实含量变异系数小，并且在成熟后期可溶性单宁含量出现升高，说明叶片和柿果实的可溶性单宁含量动态变化不一致。
2.3 柿不同时期不同部位单宁组分的差异
2.3.1 单宁混合标准品的液相色谱分析 对比混合标准品色谱图中峰的保留时间、相对分子质量和主要质谱碎片峰（图3），并参照胡湘蜀等（2015），推测化合物见表2。结合标准品对照，初步鉴定了这6种单宁组分在不同生育期的果实和叶片中均有不同呈现，且含量不尽相同。
标准曲线的绘制见表3，6种标准品的进样浓度与峰面积呈现良好的线性关系，相关系数均大于0.99，以最低浓度0.20 μg·mL-1的混合标准品，用甲醇作为溶剂做不同配比的稀释，得出6种标准品的检出限在0.10～0.30 μg·mL-1的范围中。
同时进行精密度、稳定性、回收率的实验，精密度在1.20～2.00之间，稳定性在1.20～1.89之间，回收率在96.70～100.50之间，本实验方法精密度良好，稳定性符合要求，回收率高，准确可行。
2.3.2 柿样品中各单宁组分含量
2.3.2.1 柿果肉中各单宁组分含量 由图4可知，柿果肉中检出3类单宁组分，分别为GA、GC和CA，其中GA含量明显最高，其次是CA的含量，GC的含量始终处于较低水平。随着果实的成熟，GA的含量呈现先下降后上升再下降的趋势，在幼果期最高，为215.61 μg·g-1，进入成熟阶段后显著下降，在成熟前期达到最低值，为141.82 μg·g-1;CA的含量在幼果期后显著上升，并且始终处于相对较高的水平上，最高值出现在成熟后期，为31.87 μg·g-1;相较于GA和CA的含量，GC含量明显偏低，在1.57～2.18 μg·g-1之间，变化较为平缓。
2.3.2.2 柿果皮中各单宁组分含量 由图5可知，柿果皮中检出的单宁类组分有GA、GC、CA、Rutin和EGC，CA的含量显著高于其他组分。在整个生育期中，CA在成熟前期含量最多，为735.08 μg·g-1，随后迅速降至42.43 μg·g-1，差异明显;GA在柿果皮中的含量仅次于CA，不同时期含量差异显著，在幼果期含量最高，为265.44 μg·g-1，成熟期迅速降至最低值，为10.78 μg·g-1;Rutin和GC的含量变化趋势相同，均在成熟期含量最低，其余时期变化不明显。EGC仅在幼果期和膨大期有痕量检出。
2.3.2.3 柿叶中各单宁组分含量 由图6可知，6种单宁组分在柿叶中均检出，且CA含量最高。随着柿果实的生长发育，柿叶中的CA和GC的含量呈先下降后上升趋势，且均在幼果期含量最高，分别为2 787.24 μg·g-1和132.15 μg·g-1，CA在成熟前期迅速降至最低值（1 240.14 μg·g-1），与果实生长初期差异显著，而GC在成熟期含量最低，为36.78 μg·g-1;Rutin的含量总体呈缓慢下降趋势，在幼果期含量最高，为66.07 μg·g-1;GA在成熟前期含量最高，为49.23 μg·g-1，成熟前期前后含量差异显著;EGC有微量在幼果期和膨大期检出，膨大期后已无法测到;EC在各时期有痕量检出。
3 讨论与结论
3.1 不同生育期柿单宁生物生产特性
我国主要栽培的是涩柿品种，可溶性单宁是果实产生涩味的重要因子，涩柿果实中含有0.13%～1.54%的可溶性单宁（董士远等，2002）。在鲜果消费上，涩柿果实成熟后可溶性单宁含量仍在感官阈值以上，需进行人工脱涩处理，使可溶性单宁转变为不可溶性单宁方可食用。而食品、医疗以及工业领域对柿单宁的利用中，可溶性单宁为重要的功能成分。前人研究表明，柿果实生长初期含有丰富的可溶性单宁，随着果实的成熟，可溶性单宁转化为不可溶性单宁，含量下降，果实涩味降低 （Taira， 1998）。该研究的‘恭城月柿’在幼果期和膨大期的果实可溶性单宁含量较高，进入成熟阶段后，单宁含量缓慢下降，成熟前后柿单宁含量变化差异显著，这与Taira（1998），韩卫娟等（2015）的研究结论一致，其机理可能与Yonemori et al.（2003）提出的果实在生长发育过程中单宁细胞稀释理论有关。同时，该研究发现柿叶片中可溶性单宁含量自幼果期缓慢下降，成熟后期稍有升高，整个生育期单宁含量变化平稳，这与果实的单宁含量变化之间不存在动态平衡关系，对韩卫娟等（2015）关于柿果实发育年动态变化规律的研究结果进行了补充。 3.2 柿单宁组分在不同生育期和不同果实部位中的分布规律
费学谦等（1999）研究表明，柿果肉主要单宁类成分有没食子酸（GA）、没食子儿茶素（GC）和儿茶素（CA），且在涩柿果实整个生育期中GA的含量始终最高，GC和CA的含量则始终处于较低水平，这三类成分的相对含量与果实的甘涩程度紧密相关。柿果皮中可分离出GA、CA、Rutin和EC等单宁组分（王燕，2008;任飞，2011）。柿片中已鉴定出GA和Rutin单宁组分（李羽晗等，2018）。但是，前人对柿不同部位单宁组分的研究较为零散，迄今为止，尚未有关于柿不同部位全部单宁组分的系统研究。
该实验通过对柿不同部位的单宁组分及其在整个生育期的变化规律的研究发现，果实和叶片均含GA、GC和CA组分，其中柿果肉中的GA含量最高，其次是CA的含量，GC的含量则较低，这与前人研究结果相符。柿果皮中CA的含量显著高于其他组分，且各组分含量均在成熟期降到最低，说明此时单宁组分可能存在降解，或是凝聚成单宁大分子。柿叶片中检出全部6类单宁组分，且CA的含量最丰富，其含量与柿果实中的含量变化趋势刚好相反，两部位间是否存在动态平衡关系，需做进一步研究。以上研究结果表明，柿不同部位的单宁组分构成有差异，同一组分在不同时期的含量也不同，其中检测到含量最为丰富的GA和CA组分，因其具有抗氧化、抑菌消炎、抗病毒等多种药用价值（施沈佳等，2019;乔小燕等，2019），可以作为柿单宁的有效成分更好地开发利用。
综上所述，‘恭城月柿’成熟前果实可生产大量可溶性单宁，同时果肉中含有较高的GA组分，果皮和叶片中含有丰富的CA组分。研究通过探明柿单宁的生物生产特性，为柿单宁及其组分的功能性开发利用提供参考。
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（責任编辑 何永艳）
关键词： 柿， 生育期， 单宁， 组分， 液相色谱质谱联用
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文章编号： 1000-3142（2020）05-0735-09
Changes of tannin component content in persimmon fruits and leaves at different growth and development periods
LU Di1， HUANG Sijie1， LONG Minghua1， SUN Ningjing2*
（ 1. College of Agriculture， Guangxi University， Nanning 530004， China; 2. College of Resources and Environment Sciences， Baoshan University， Baoshan 678000， Yunnan， China ）
Abstract： Persimmon tannin is an important food functional component， which is widely used in food industry， medicine and other fields. Therefore， the study on persimmon tannin biological production pattern has its significance to the industry application. ‘Gongcheng’ persimmon is the unique cultivar in Guangxi， this cultivar is a typical astringent type which means it has high level tannin content. In the present study， took ‘Gongcheng’ persimmon was taken as experiment material， to reveal the changes of soluble tannin component content in fruits and leaves at the growth and development periods. Soluble tannin contents in the flesh， peels and leaves of persimmon fruits at young period， expansion period， early mature period， mature period and late mature period were determined. Six tannin components such as gallic acid （GA）， gallocatechin （GC）， catechin （CA）， rutin （Rutin）， epigallocatechin （EGC） and epigallocatechin （EC） in all samples were quantitatively analyzed by LC-MS. The results were as follows： Soluble tannin were rich in persimmon flesh and skin， and the content was the highest in the expansion period， reaching 21.93 and 18.41 mg·g-1， then decreased significantly as fruit matured. The soluble tannin content in persimmon leaves was low， and there was no significant changes during the whole growth period. In addition， three tannin components like GA， GC and CA were detected in persimmon flesh， while GA content was significantly higher than other components. Five components such as GA， GC， CA， Rutin and EGC were detected in persimmon peels， while the content of CA was the highest， and EGC only had trace detection at young and expansion periods. All six tannin components were detected in persimmon leaves， among which CA content was markedly high during the whole growth period， however both EGC and EC were just detected in trace amounts. Therefore， more soluble tannin production would be found in persimmon fruits from young period to expansion period， the flesh contains a great quantity of GA and the peel contains a large amount of CA component. Persimmon leaves could produce abundant CA component in the whole growth period. Key words： persimmon， growth and development periods， tannin， component， LC-MS
柿树属于柿科（Ebenaceae）柿属（Diospyros L.）多年生落叶果树，已有1 000多年的栽培历史（Naval et al.， 2010）。柿果实中含有丰富的糖、酸、维生素、胡萝卜素等营养成分，既可鲜食，也可加工成柿饼、饮品等（顾海峰，2007）。国内外研究报道，柿叶中含有的多酚类、黄酮类、萜类、香豆素类和甾醇类等多种生理活性物质（任飞，2011;杨琼琼等，2016），具有抗癌、抗衰老、调节免疫等多种药理作用（王燕，2008）。此外，柿含有丰富的单宁类物质，高出普通水果十几倍甚至几十倍。单宁是决定果实涩味的主要因子（Sugiura， 1984），具有抗氧化（罗正荣和张青林，2009）、抑菌（董晓倩，2014）、缓解蛇毒（徐淑芬等，2011）、清肺止咳（Itamura et al.， 2011）、吸附重金属（罗正荣和张青林，2009）等功效。
柿单宁是植物多酚的一种，根据其溶解程度，分为可溶性单宁和不可溶性单宁。可溶性单宁是决定柿果实涩味的主要物质。可溶性单宁可用无水甲醇提取，不可溶性单宁不溶于无水甲醇，而溶于甲醇的水溶液，当提取条件改变时不可溶性单宁可转变为可溶性单宁（胡耀星和谢笔钧，1991;Taira， 1998）。
柿单宁不同于其他水果单宁，具有独特的结构特征（Li et al.， 2010）。早在1923年，Komats和Mutsua就对柿单宁分子进行了研究，从柿果实提出多酚类物质，并把这种物质命名为“柿子素” （张宝善和陈绵屏，1997）。其后，Matsuo & Ito（1978）采用NMR的手段鉴定其结构，并提出其主要的组成结构分子为4种儿茶素类（Flavanpentol）单体——表儿茶素（EC）、表儿茶素没食子酸（ECG）、表没食子酸酸儿茶素（EGC）和表没食子酸儿茶素没食子酸（EGCG），组成比例为1∶1∶2∶2，并推测出其分子量约为13 000。前人研究发现，200 g的涩柿约含有80 g儿茶素类，且仅为EC和EGCG，其余则为3 g的可溶性单宁（Salvador et al.， 2007）。
柿单宁分子结构多样且复杂，目前对柿单宁的研究主要集中在初步提纯并验证其抗氧化活性方面，对其组成成分的分析和其他功能性的开发较少。因此本研究以广西主栽的特色涩柿品种‘恭城月柿’为材料，研究其不同生育期果实和叶片中可溶性单宁及其单宁组分含量的变化规律，为后續功能性开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂和仪器
供试材料：广西大学植物标本园栽植的‘恭城月柿’品种，分别采摘于5个时期：幼果期（2017年8月9日）、膨大期（2017年8月31日）、成熟前期（2017年9月30日）、成熟期（2017年10月28日）和成熟后期（2017年11月19日）。选取大小均匀、成熟度一致、无病虫害且无机械损伤的果实和柿叶，分3个生物学重复测定其单果重、硬度及总色差，同时分离果肉和果皮，液氮冷冻后保存于-40 ℃，以备后续定量分析。
试剂：乙腈，质谱纯（Fisher Chemical公司）;标准品：儿茶素（CA）、表儿茶素（EC）、没食子酸（GA）、没食子儿茶素（GC）、表没食子儿茶素（EGC）、芦丁（Rutin），含量≥95%（北京索莱宝科技有限公司）;其他试剂均为国产分析纯。
仪器设备：质构仪TA.XT.Plus（英国，Stable Micro System公司）;超高效液相色谱—四级杆串联飞行时间质谱仪（UPLC-QTOF）（配有可变波长紫外检测器 ADC 和数据采集与分析软件 Masslynx 4.1 工作站，美国Waters公司）;旋转蒸发仪;分析天平;离心机。
1.2 实验方法
1.2.1 单果重、硬度、总色差的测定 每个时期果实分3个生物学重复，每个生物学重复随机取10个果实，用百分之一天平称量，记录单果重并计算平均值。
硬度的测定选取质构仪TA.XT.Plus（英国，Stable Micro Systems公司）对果实硬度进行测定，分别选取柿果实赤道上相反方向的两个面，削去果皮，采用直径为5 mm的圆柱形探头进行穿刺测定。
总色差的测定采用CR-10色差计对果实色差进行测定（日本，KONICA MINOLTA公司），记录L、a、b值，计算总色差ΔE值。计算公式：ΔE=（ΔL）2+（Δa）2+（Δb）2。其中，设幼果期的L、a、b值为标准值，其他时期的L、a、b值为测定值，测定值与标准值之差即为ΔL、Δa、Δb值。
1.2.2 可溶性单宁的测定 可溶性单宁的测定参照Taira（1996）的方法并做部分改良。取5 g果肉（果皮、柿叶）加入80%的甲醇25 mL，室温下放置10 min，期间摇动3次，于温度为4 ℃，转速为9 500 r·s-1条件下离心20 min，重复提取两次，合并提取液，用80%的甲醇定容至100 mL。样液稀释至1 000 mL，先取稀释后的待测样液1 mL，加入6 mL蒸馏水;摇匀后加入0.5 mL 1 N的福林酚试剂，摇匀，静置3 min;然后加入1 mL饱和Na2CO3溶液和1.5 mL的蒸馏水，摇匀;最后，避光条件下静置1 h，于725 nm处测定吸光值。
1.2.3 单宁组分测定 样品制备：提取方法同1.2.2方法，将粗提液浓缩至10 mL，取1 mL于 0. 22 μm 微孔滤膜过滤后装入2 mL进样瓶备用。
色谱条件：色谱柱Waters Acquity-BCH C18（100 mm ×2.1 mm，0.18 μm），流速0. 2 mL·min-1，柱温30 ℃，二极管阵列检测器（ADC）检测波长280 nm，进样量2 μL，梯度洗脱条件见表 1。 质谱条件：采用电离子喷雾（ESI）法。毛细管电压2.5 kV，锥孔电压30 V，扫描范围50～1 200 Da，离子源温度100 ℃，脱溶剂温度350 ℃，锥孔气流量50 L·h-1，脱溶剂气流量700 L·h-1。
标准溶液的配置：称取GC、EC、EGC、GA、CA、Rutin各1.0 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成标准混合样品储备液。使用前将混合母液用甲醇分别稀释成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg·mL-1等不同浓度的混合标样，分别取1 mL于0.22 μm微孔滤膜过滤后装入2 mL进样瓶备用。
1.3 统计分析
采用SPSS 17.0软件的单因素方差分析方法对数据进行统计分析，并利用Excel 2007进行数据处理及制图。
2 结果与分析
2.1 柿不同时期单果重、硬度、总色差变化规律
由图1：A可知，随着柿果实的生长发育，单果重整体呈显著上升趋势。具体地，单果重从幼果期到膨大期上升幅度最大，上升了30.47 g;膨大期到成熟前期增幅最小，仅上升了9.86 g，说明从幼果期到膨大期果实发育迅速，膨大期到成熟前期发育缓慢。
由图1：B可知，柿果实的硬度呈明显下降趋势，其中从成熟前期到成熟期果实的硬度下降最为显著，降低了11.46 N。
由图1：C可知， 随着果实的成熟，总色差ΔE值显著上升，其中成熟前期到成熟期增幅最大，增长了8.7，说明此时果实转色成熟。
2.2 柿不同时期不同部位可溶性单宁含量的变化
由图2可知，柿果肉和果皮中可溶性单宁含量均在膨大期最高，分别为21.93、18.41 mg·g-1，進入成熟阶段后，可溶性单宁含量显著下降，于成熟后期降至最低，分别为11.27、2.47 mg·g-1;各时期柿叶中的可溶性单宁含量在5.51～9.43 mg·g-1之间波动，相对于柿果实含量变异系数小，并且在成熟后期可溶性单宁含量出现升高，说明叶片和柿果实的可溶性单宁含量动态变化不一致。
2.3 柿不同时期不同部位单宁组分的差异
2.3.1 单宁混合标准品的液相色谱分析 对比混合标准品色谱图中峰的保留时间、相对分子质量和主要质谱碎片峰（图3），并参照胡湘蜀等（2015），推测化合物见表2。结合标准品对照，初步鉴定了这6种单宁组分在不同生育期的果实和叶片中均有不同呈现，且含量不尽相同。
标准曲线的绘制见表3，6种标准品的进样浓度与峰面积呈现良好的线性关系，相关系数均大于0.99，以最低浓度0.20 μg·mL-1的混合标准品，用甲醇作为溶剂做不同配比的稀释，得出6种标准品的检出限在0.10～0.30 μg·mL-1的范围中。
同时进行精密度、稳定性、回收率的实验，精密度在1.20～2.00之间，稳定性在1.20～1.89之间，回收率在96.70～100.50之间，本实验方法精密度良好，稳定性符合要求，回收率高，准确可行。
2.3.2 柿样品中各单宁组分含量
2.3.2.1 柿果肉中各单宁组分含量 由图4可知，柿果肉中检出3类单宁组分，分别为GA、GC和CA，其中GA含量明显最高，其次是CA的含量，GC的含量始终处于较低水平。随着果实的成熟，GA的含量呈现先下降后上升再下降的趋势，在幼果期最高，为215.61 μg·g-1，进入成熟阶段后显著下降，在成熟前期达到最低值，为141.82 μg·g-1;CA的含量在幼果期后显著上升，并且始终处于相对较高的水平上，最高值出现在成熟后期，为31.87 μg·g-1;相较于GA和CA的含量，GC含量明显偏低，在1.57～2.18 μg·g-1之间，变化较为平缓。
2.3.2.2 柿果皮中各单宁组分含量 由图5可知，柿果皮中检出的单宁类组分有GA、GC、CA、Rutin和EGC，CA的含量显著高于其他组分。在整个生育期中，CA在成熟前期含量最多，为735.08 μg·g-1，随后迅速降至42.43 μg·g-1，差异明显;GA在柿果皮中的含量仅次于CA，不同时期含量差异显著，在幼果期含量最高，为265.44 μg·g-1，成熟期迅速降至最低值，为10.78 μg·g-1;Rutin和GC的含量变化趋势相同，均在成熟期含量最低，其余时期变化不明显。EGC仅在幼果期和膨大期有痕量检出。
2.3.2.3 柿叶中各单宁组分含量 由图6可知，6种单宁组分在柿叶中均检出，且CA含量最高。随着柿果实的生长发育，柿叶中的CA和GC的含量呈先下降后上升趋势，且均在幼果期含量最高，分别为2 787.24 μg·g-1和132.15 μg·g-1，CA在成熟前期迅速降至最低值（1 240.14 μg·g-1），与果实生长初期差异显著，而GC在成熟期含量最低，为36.78 μg·g-1;Rutin的含量总体呈缓慢下降趋势，在幼果期含量最高，为66.07 μg·g-1;GA在成熟前期含量最高，为49.23 μg·g-1，成熟前期前后含量差异显著;EGC有微量在幼果期和膨大期检出，膨大期后已无法测到;EC在各时期有痕量检出。
3 讨论与结论
3.1 不同生育期柿单宁生物生产特性
我国主要栽培的是涩柿品种，可溶性单宁是果实产生涩味的重要因子，涩柿果实中含有0.13%～1.54%的可溶性单宁（董士远等，2002）。在鲜果消费上，涩柿果实成熟后可溶性单宁含量仍在感官阈值以上，需进行人工脱涩处理，使可溶性单宁转变为不可溶性单宁方可食用。而食品、医疗以及工业领域对柿单宁的利用中，可溶性单宁为重要的功能成分。前人研究表明，柿果实生长初期含有丰富的可溶性单宁，随着果实的成熟，可溶性单宁转化为不可溶性单宁，含量下降，果实涩味降低 （Taira， 1998）。该研究的‘恭城月柿’在幼果期和膨大期的果实可溶性单宁含量较高，进入成熟阶段后，单宁含量缓慢下降，成熟前后柿单宁含量变化差异显著，这与Taira（1998），韩卫娟等（2015）的研究结论一致，其机理可能与Yonemori et al.（2003）提出的果实在生长发育过程中单宁细胞稀释理论有关。同时，该研究发现柿叶片中可溶性单宁含量自幼果期缓慢下降，成熟后期稍有升高，整个生育期单宁含量变化平稳，这与果实的单宁含量变化之间不存在动态平衡关系，对韩卫娟等（2015）关于柿果实发育年动态变化规律的研究结果进行了补充。 3.2 柿单宁组分在不同生育期和不同果实部位中的分布规律
费学谦等（1999）研究表明，柿果肉主要单宁类成分有没食子酸（GA）、没食子儿茶素（GC）和儿茶素（CA），且在涩柿果实整个生育期中GA的含量始终最高，GC和CA的含量则始终处于较低水平，这三类成分的相对含量与果实的甘涩程度紧密相关。柿果皮中可分离出GA、CA、Rutin和EC等单宁组分（王燕，2008;任飞，2011）。柿片中已鉴定出GA和Rutin单宁组分（李羽晗等，2018）。但是，前人对柿不同部位单宁组分的研究较为零散，迄今为止，尚未有关于柿不同部位全部单宁组分的系统研究。
该实验通过对柿不同部位的单宁组分及其在整个生育期的变化规律的研究发现，果实和叶片均含GA、GC和CA组分，其中柿果肉中的GA含量最高，其次是CA的含量，GC的含量则较低，这与前人研究结果相符。柿果皮中CA的含量显著高于其他组分，且各组分含量均在成熟期降到最低，说明此时单宁组分可能存在降解，或是凝聚成单宁大分子。柿叶片中检出全部6类单宁组分，且CA的含量最丰富，其含量与柿果实中的含量变化趋势刚好相反，两部位间是否存在动态平衡关系，需做进一步研究。以上研究结果表明，柿不同部位的单宁组分构成有差异，同一组分在不同时期的含量也不同，其中检测到含量最为丰富的GA和CA组分，因其具有抗氧化、抑菌消炎、抗病毒等多种药用价值（施沈佳等，2019;乔小燕等，2019），可以作为柿单宁的有效成分更好地开发利用。
综上所述，‘恭城月柿’成熟前果实可生产大量可溶性单宁，同时果肉中含有较高的GA组分，果皮和叶片中含有丰富的CA组分。研究通过探明柿单宁的生物生产特性，为柿单宁及其组分的功能性开发利用提供参考。
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（責任编辑 何永艳）