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摘要：建立了鸭、鹅组织中乙氧酰胺苯甲酯残留量检测的高效液相色分析方法。试样中残留的乙氧酰胺苯甲酯用乙腈提取，浓缩后用正己烷-丙酮溶解残余物，硅酸镁固相萃取柱净化，用甲醇洗脱，收集洗脱液作为试样溶液供高效液相色谱测定。该方法在乙氧酰胺苯甲酯0.05～5.0 μg/mL的系列浓度范围内均呈良好线性关系，相关系数（r）均大于0.990。肌肉样品中乙氧酰胺苯甲酯的检测限为20 μg/kg，定量限为50 μg/kg；肝、肾样品中乙氧酰胺苯甲酯的检测限为50 μg/kg，定量限为100 μg/kg；各组织样品中平均添加回收率均为70 % ～110%，相对标准偏差（RSD）均小于20%。该方法具有简便快捷、灵敏度高、定性准确等特点。
关键词：鸭、鹅可食组织；乙氧酰胺苯甲酯；残留；高效液相色谱
中图分类号： O657.7 2 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）03-0265-03
乙氧酰胺苯甲酯化学名为4-乙酰胺基-2-乙氧基苯甲酸甲酯，系一种抗原虫（球虫） 药，主要与某些抗球虫药合用作为抗球虫药的增效剂用于家禽饲料中，如与氨丙啉、氨丙啉与磺胺喹[XCZ1.tif]啉混合用于控制鸡球虫病，在国内养殖业应用广泛。蛋鸡在产蛋期禁用，休药期为3 d。如果中间停止用药，球虫会再发育，故连续使用才有效果[1]。由于用药时间较长，药物必然在肉中残留，被人食用后会直接危害人体健康，所以我国规定了严格的休药期，鸡在上市或开产前3 d必须停药。由于科学知识的缺乏和经济利益的驱使，畜牧业中不按国家规定滥用兽药和超标使用兽药的现象普遍存在，这不仅影响到广大人民群众的日常生活，而且随着我国加入WTO，国内外贸易的频繁往来，也严重影响到我国的出口创汇。
2002年发布的中华人民共和国农业部公告第235号《动物性食品中兽药最高残留限量》规定乙氧酰胺苯甲酯在禽组织中的最高残留限量为：肌肉500 μg/kg，肝和肾1 500 μg/kg。乙氧酰胺苯甲酯在鸡体内不发生代谢，以药物原型排出。农牧发[2001]38号文发布了动物源食品中乙氧酰胺苯甲酯残留检测方法——高效液相色谱法，但是该标准只适用于鸡的肌肉、脂肪、肝脏、肾脏组织中的乙氧酰胺苯甲酯残留量的检测。因此，我们对鹅、鸭的肌肉、肝和肾组织中的乙氧酰胺苯甲酯残留的检测方法做了研究。本试验在已有的适用于鸡组织中的乙氧酰胺苯甲酯标准[2]的基础上，改进提取步骤，用高效液相色谱法检测，使得试验操作简单、易行、耗时少。该方法具有操作简单、检测限低、重现性好、测定费用低的特点，适用于定量检测动物性食品中乙氧酰胺苯甲酯的残留量。
1 材料和方法
1.1 儀器
高效液相色谱仪（配紫外检测器）（Waters公司）；MP200B天平；台式高速冷冻离心机（贝克曼公司）；R-200旋转蒸发仪（润湿BUCHI）；固相萃取装置；XW-80A涡旋混合器（上海精科实业有限公司）；HY-4调速多用振荡器。
1.2 试剂
乙氧酰胺苯甲酯对照品：含量≥98.5%（Dr.Ehrenstorfer公司）；乙腈、甲醇为色谱纯（Fisher公司）；正己烷、丙酮、无水硫酸钠（分析纯）；试验用水均为超纯水。
1.3 标准溶液配制
1.3.1 乙氧酰胺苯甲酯标准储备液（100 μg/mL） 称取乙氧酰胺苯甲酯对照品10.0 mg（精确到0.1 mg），用甲醇溶解并定溶至100 mL，置4 ℃储存，有效期为1周。
1.3.2 标准工作液 量取标准储备液适量，用甲醇稀释成浓度分别为5.0、2.5、1.0、0.5、0.25、0.10、0.05 μg/mL的对照溶液，供高效液相色谱分析，临用前配制。
1.4 试验方法
1.4.1 样品前处理
1.4.1.1 提取
称取（5.00 ± 0.05） g匀浆试样，置于 50 mL 具塞离心管中，加入乙腈15 mL，无水硫酸钠10 g，正己烷10 mL，涡旋混合1 min，振荡提取5 min，4 000 r/min离心10 min。用滴管吸取下层乙腈于鸡心瓶中备用。向剩余沉淀物中再加入乙腈15 mL，重新提取1次，合并2次的乙腈提取液于同一鸡心瓶中，于45 ℃下旋转蒸发至近干。取正己烷-丙酮（9 ∶1）5.0 mL溶解上述残留物，超声30 s，摇匀，然后转移至10 mL离心管中，4 000 r/min离心10 min，上清液备用。
1.4.1.2 净化
硅酸镁固相萃取柱用甲醇5 mL预洗。取上述上清液1.0 mL过柱，用正己烷3 mL淋洗，挤干。用甲醇1.0 mL洗脱，挤干，收集洗脱液，用0.45 μm的有机滤膜过滤后作为试样溶液，供高效液相色谱测定。
1.4.2 色谱条件 色谱柱：C18柱，250 mm × 4.6 mm（i.d.）；流动相：乙腈-水（30 ∶70）；流速：1.0 mL/min；检测波长：270 nm；进样量：10 μL。
1.4.3 标准曲线的绘制 配制浓度为0.05、0.10、0.25、050、1.0、2.5、5.0 μg/mL的系列标准溶液，高效液相色谱测定后，乙氧酰胺苯甲酯峰面积为纵坐标，相应浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。
1.4.4 灵敏度 在空白鹅、鸭的肌肉组织中添加乙氧酰胺苯甲酯对照溶液，按确定的提取净化方法处理后，经高效液相色谱检测，计算信噪比。
1.4.5 准确度与精密度 采用标准加入法，在鹅、鸭的组织中添加不同浓度乙氧酰胺苯甲酯进行回收率试验。各浓度进行5个平行试验，重复3次，求批内、批间相对标准偏差。
2 结果与分析
2.1 标准曲线 标准工作曲线（图1）回归方程为：y=45 828x 177.61，r为0.999 9。
3 讨论
3.1 样品前处理条件的优化
本试验对徐士新等的提取方法[2]進行优化改进。修订后的方法，在组织残留提取时，同时加入乙腈、无水硫酸钠和正己烷进行提取，去掉了匀浆、过滤、静置3个步骤，使耗材减少、操作更简单、减少了提取过程的的损失（降低了样品的检测限和定量限），节省了时间，使用修订后的方法进行添加回收测定试验，结果回收率均在80%以上。
3.2 色谱方法的优化
液相方法首先通过色谱扫描确定检测波长为270 nm时，信号强度最高[4]；采用优化流动相乙腈与水的配比，发现在30 ∶70的条件下获得的峰形最好；流速采用常用的 1.0 mL/min。综合以上色谱优化条件，可以获得良好的试验结果。
4 小结
本方法采用乙腈提取、硅酸镁固相萃取柱净化，高效液相色谱法测定，成功建立了动物性食品中乙氧酰胺苯甲酯的残留检测方法。在鹅、鸭的肌肉中乙氧酰胺苯甲酯的检测限为20 μg/kg，最低定量限为50 μg/kg。在鹅、鸭的肝脏、肾脏中乙氧酰胺苯甲酯的检测限为50 μg/kg，最低定量限为 100 μg/kg。整个试验过程简单、快速，回收率较高，适用于动物性食品中乙氧酰胺苯甲酯残留的定量检测。
参考文献：[HJ1.4mm]
[1]丁佳雯，翁亚彪，朱建荣. 乙氧酰胺苯甲酯等药物防治鸡盲肠球虫病的疗效试验[J]. 养禽与禽病防治，2004（10）：2-3.
[2]徐士新，仲 锋，郭文林. 乙氧酰胺苯甲酯在鸡组织中残留的检测及消除规律的研究[J]. 中国兽药杂志，1999（3）：6-11.
[3]农业部. 兽药残留试验技术规范（试行）[S]. 1999：6-11.
[4]Taahashi Y，Sekiya T，Nishikawa M，et al. Simultaneous high-performance liquid chromatographic determination of amprolium，ethopabate，sulfaquinoxaline and N4-acetylsulfaquinoxaline in chicken tissues[J]. Journal of Liquid Chromatography，1994，17（20）：4489-4512.
关键词：鸭、鹅可食组织；乙氧酰胺苯甲酯；残留；高效液相色谱
中图分类号： O657.7 2 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）03-0265-03
乙氧酰胺苯甲酯化学名为4-乙酰胺基-2-乙氧基苯甲酸甲酯，系一种抗原虫（球虫） 药，主要与某些抗球虫药合用作为抗球虫药的增效剂用于家禽饲料中，如与氨丙啉、氨丙啉与磺胺喹[XCZ1.tif]啉混合用于控制鸡球虫病，在国内养殖业应用广泛。蛋鸡在产蛋期禁用，休药期为3 d。如果中间停止用药，球虫会再发育，故连续使用才有效果[1]。由于用药时间较长，药物必然在肉中残留，被人食用后会直接危害人体健康，所以我国规定了严格的休药期，鸡在上市或开产前3 d必须停药。由于科学知识的缺乏和经济利益的驱使，畜牧业中不按国家规定滥用兽药和超标使用兽药的现象普遍存在，这不仅影响到广大人民群众的日常生活，而且随着我国加入WTO，国内外贸易的频繁往来，也严重影响到我国的出口创汇。
2002年发布的中华人民共和国农业部公告第235号《动物性食品中兽药最高残留限量》规定乙氧酰胺苯甲酯在禽组织中的最高残留限量为：肌肉500 μg/kg，肝和肾1 500 μg/kg。乙氧酰胺苯甲酯在鸡体内不发生代谢，以药物原型排出。农牧发[2001]38号文发布了动物源食品中乙氧酰胺苯甲酯残留检测方法——高效液相色谱法，但是该标准只适用于鸡的肌肉、脂肪、肝脏、肾脏组织中的乙氧酰胺苯甲酯残留量的检测。因此，我们对鹅、鸭的肌肉、肝和肾组织中的乙氧酰胺苯甲酯残留的检测方法做了研究。本试验在已有的适用于鸡组织中的乙氧酰胺苯甲酯标准[2]的基础上，改进提取步骤，用高效液相色谱法检测，使得试验操作简单、易行、耗时少。该方法具有操作简单、检测限低、重现性好、测定费用低的特点，适用于定量检测动物性食品中乙氧酰胺苯甲酯的残留量。
1 材料和方法
1.1 儀器
高效液相色谱仪（配紫外检测器）（Waters公司）；MP200B天平；台式高速冷冻离心机（贝克曼公司）；R-200旋转蒸发仪（润湿BUCHI）；固相萃取装置；XW-80A涡旋混合器（上海精科实业有限公司）；HY-4调速多用振荡器。
1.2 试剂
乙氧酰胺苯甲酯对照品：含量≥98.5%（Dr.Ehrenstorfer公司）；乙腈、甲醇为色谱纯（Fisher公司）；正己烷、丙酮、无水硫酸钠（分析纯）；试验用水均为超纯水。
1.3 标准溶液配制
1.3.1 乙氧酰胺苯甲酯标准储备液（100 μg/mL） 称取乙氧酰胺苯甲酯对照品10.0 mg（精确到0.1 mg），用甲醇溶解并定溶至100 mL，置4 ℃储存，有效期为1周。
1.3.2 标准工作液 量取标准储备液适量，用甲醇稀释成浓度分别为5.0、2.5、1.0、0.5、0.25、0.10、0.05 μg/mL的对照溶液，供高效液相色谱分析，临用前配制。
1.4 试验方法
1.4.1 样品前处理
1.4.1.1 提取
称取（5.00 ± 0.05） g匀浆试样，置于 50 mL 具塞离心管中，加入乙腈15 mL，无水硫酸钠10 g，正己烷10 mL，涡旋混合1 min，振荡提取5 min，4 000 r/min离心10 min。用滴管吸取下层乙腈于鸡心瓶中备用。向剩余沉淀物中再加入乙腈15 mL，重新提取1次，合并2次的乙腈提取液于同一鸡心瓶中，于45 ℃下旋转蒸发至近干。取正己烷-丙酮（9 ∶1）5.0 mL溶解上述残留物，超声30 s，摇匀，然后转移至10 mL离心管中，4 000 r/min离心10 min，上清液备用。
1.4.1.2 净化
硅酸镁固相萃取柱用甲醇5 mL预洗。取上述上清液1.0 mL过柱，用正己烷3 mL淋洗，挤干。用甲醇1.0 mL洗脱，挤干，收集洗脱液，用0.45 μm的有机滤膜过滤后作为试样溶液，供高效液相色谱测定。
1.4.2 色谱条件 色谱柱：C18柱，250 mm × 4.6 mm（i.d.）；流动相：乙腈-水（30 ∶70）；流速：1.0 mL/min；检测波长：270 nm；进样量：10 μL。
1.4.3 标准曲线的绘制 配制浓度为0.05、0.10、0.25、050、1.0、2.5、5.0 μg/mL的系列标准溶液，高效液相色谱测定后，乙氧酰胺苯甲酯峰面积为纵坐标，相应浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。
1.4.4 灵敏度 在空白鹅、鸭的肌肉组织中添加乙氧酰胺苯甲酯对照溶液，按确定的提取净化方法处理后，经高效液相色谱检测，计算信噪比。
1.4.5 准确度与精密度 采用标准加入法，在鹅、鸭的组织中添加不同浓度乙氧酰胺苯甲酯进行回收率试验。各浓度进行5个平行试验，重复3次，求批内、批间相对标准偏差。
2 结果与分析
2.1 标准曲线 标准工作曲线（图1）回归方程为：y=45 828x 177.61，r为0.999 9。
3 讨论
3.1 样品前处理条件的优化
本试验对徐士新等的提取方法[2]進行优化改进。修订后的方法，在组织残留提取时，同时加入乙腈、无水硫酸钠和正己烷进行提取，去掉了匀浆、过滤、静置3个步骤，使耗材减少、操作更简单、减少了提取过程的的损失（降低了样品的检测限和定量限），节省了时间，使用修订后的方法进行添加回收测定试验，结果回收率均在80%以上。
3.2 色谱方法的优化
液相方法首先通过色谱扫描确定检测波长为270 nm时，信号强度最高[4]；采用优化流动相乙腈与水的配比，发现在30 ∶70的条件下获得的峰形最好；流速采用常用的 1.0 mL/min。综合以上色谱优化条件，可以获得良好的试验结果。
4 小结
本方法采用乙腈提取、硅酸镁固相萃取柱净化，高效液相色谱法测定，成功建立了动物性食品中乙氧酰胺苯甲酯的残留检测方法。在鹅、鸭的肌肉中乙氧酰胺苯甲酯的检测限为20 μg/kg，最低定量限为50 μg/kg。在鹅、鸭的肝脏、肾脏中乙氧酰胺苯甲酯的检测限为50 μg/kg，最低定量限为 100 μg/kg。整个试验过程简单、快速，回收率较高，适用于动物性食品中乙氧酰胺苯甲酯残留的定量检测。
参考文献：[HJ1.4mm]
[1]丁佳雯，翁亚彪，朱建荣. 乙氧酰胺苯甲酯等药物防治鸡盲肠球虫病的疗效试验[J]. 养禽与禽病防治，2004（10）：2-3.
[2]徐士新，仲 锋，郭文林. 乙氧酰胺苯甲酯在鸡组织中残留的检测及消除规律的研究[J]. 中国兽药杂志，1999（3）：6-11.
[3]农业部. 兽药残留试验技术规范（试行）[S]. 1999：6-11.
[4]Taahashi Y，Sekiya T，Nishikawa M，et al. Simultaneous high-performance liquid chromatographic determination of amprolium，ethopabate，sulfaquinoxaline and N4-acetylsulfaquinoxaline in chicken tissues[J]. Journal of Liquid Chromatography，1994，17（20）：4489-4512.