论文部分内容阅读
【摘 要】 目的：建立疏肝和胃颗粒的质量标准。方法：采用薄层色谱对元胡、大黄、香附进行定性鉴别；采用高效液相色谱测定制剂中高良姜素的含量，色谱柱为inertsil C18（150mm×4-6mm，5μm）；流动相为甲醇-0-2%磷酸溶液（60∶ 40）；检测波长为266nm；柱温31℃，理论塔板数按高良姜素计算应不低于6000。结果：薄层色谱斑点清晰，分离度良好，阴性无干扰，专属性强，重复性良好；高良姜素在0-081～1-62μg/ml（r=0-9999）区间内线性关系良好，平均回收率为97-93%，RSD为1-18%。结论：本方法方便、可靠、准确，可用于疏肝和胃颗粒的质量控制。
【关键词】 疏肝和胃颗粒；质量标准；高良姜素；薄层色谱；高效液相色谱
【中图分类号】R286-0 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）18-0014-03
Research on the Quality Standard of Shugan Hewei Granules
MAO Heping ZOU Ganpeng LIU Guangbin*
Department of Pharmacy，jiugang Hospital，Jiayuguan 735100，China
Abstract：ObjectiveTo formulate the quality standard for Shugan Hewei granules.MethodsThe qualities of Yuanhu（Rhizoma Corydalis yanhusuo W.T.Wang），Dahuang（Radix et Rhizoma Rhei）and Xiangfu（Rhizoma Cyperus rotundus I）in the granules were identified by microscopic examination；Thenatures of Yuanhu， Dahuang and xiangfu were detected by layer chromatography（TLC）and the contents of it measured by HPLC were inertsil C18 column，（15mm×4-6mm，5μm）、methanol-0-2% H3PO4=60/40，v/v， as mobile phase，0-8ml/min as flow speed and wavelength 266nm. Results The result objectived by microscopy were obvious；The TLC spots developed were clear with efficient separating ability，which were negative noninterferencs with the characterstics of high specificity and satisfactory reproducibility；The linear relation between psoralen among 0-081μg/ml-1-62μg/ml（r=0-9999）was excellent；The average recoveries of psoralen and isopsoralen were 97-93% （RSD=1-18%，n=6）respectively。ConclusionTLC and HPLC are handy，safe and accurate for Shugan Hewei granules todetermine the quality。
Keywords：Shugan Hewei Granules；Quality Standard；Galangin；TLC；HPLC
疏肝和胃颗粒是酒钢医院的医院制剂，由高良姜、香附、白芍等7味药物组成，具有疏肝理气、温中和胃、控酸止痛之功效，临床常用于治疗肝胃失和所致的胃脘痛。研究采用薄层色谱法对元胡、大黄、香附进行鉴别，采用高效液相法（HPLC）测定高良姜素的含量，为全面有效控制疏肝和胃颗粒的质量提供实验依据。
1 仪器与材料
1-1 仪器 岛津LC-15C高效液相色谱仪（SPD-15C紫外检测器，LC solution15C色谱工作站）；分析天平（Sartorious）。
1-2 材料 高良姜素对照品（批号：111699-200501）、延胡索乙素对照品（批号：0726-200107）、大黄酸对照品（批号：110757-200206）、香附对照药材（批号121059-200706）均购于中国食品药品检定研究院；硅胶GF254薄层板、硅胶G薄层板、硅膠H薄层板均购于青岛海洋化工有限公司；自制疏肝和胃颗粒（批号：20120201、20120202、20120203、20120204、20120205、20120206）和阴性样品（酒钢医院制）；甲醇、磷酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2-1 TLC鉴别
2-1-1 元胡TLC鉴别[1]22 取疏肝和胃颗粒30g，加甲醇50ml，超声处理30min，0-45μm滤膜滤过，蒸干滤液；残渣加水10ml溶解，加浓氨试液调至碱性；用乙醚振摇提取3次，每次10ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，做为供试品。取阴性供试品（缺元胡）30g，同法制备阴性溶液。取延胡索乙素对照品5-1mg置于10ml容量瓶中，用甲醇定容，做为对照品溶液。按照薄层色谱法，取硅胶G薄层板用3%NaOH溶液浸泡3秒，105℃活化30min，置干燥器备用。吸取上述三种溶液各4～6μl，分别点于处理好的同一薄层板上，以甲苯-丙酮（9∶ 2）为展开剂展开，取出，晾干；然后置碘缸中约3min后取出，挥尽板上吸附的碘后，置紫外光灯365nm下检视。结果供试品在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性样品在此位置无干扰。见图1。 2-1-2 大黄TLC鉴别[1]130，[2-3] 取疏肝和胃颗粒3g，加甲醇20ml，超声处理30min，静置1h，0-45μm滤膜滤过，取滤液5ml蒸干；残渣加水10ml使溶解，加盐酸1ml，加热回流30min，立即冷却；用乙醚振摇提取2次，每次20ml，合并乙醚液，蒸干；残渣加三氯甲烷1ml使溶解，做为供试品。取阴性供试品（缺大黄）3g，同法制备阴性溶液。取大黄酸对照品5mg于5ml容量瓶中，用甲醇定容，做为对照品。按照薄层色谱法，吸取上述三种溶液各4μl，分别点于同一硅胶H薄层板上，以石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶ 6∶ 1）为展开剂展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视。结果供试品在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性样品在此位置无干扰。见图2。
2-1-3 香附的TLC鉴别[1]241 取疏肝和胃颗粒12g，加乙醚5ml，超声处理60min，滤纸滤过，滤液蒸干；残渣用乙酸乙酯5ml溶解，做为供试品。取阴性供试品（缺香附）12g，同法制备阴性溶液。取香附对照药材0-2568g，加乙醚20ml，超声处理60min，滤纸滤过，滤液挥干，加乙酸乙酯0-125ml溶解，做为对照药材溶液。按照薄层色谱法，取经105℃活化30min的硅胶GF254薄层板，吸取上述三种溶液各2μl，分别点于同一薄层板上，展开时薄层板与展开缸底部接近90°，以二氯甲烷为展开剂展开，取出，晾干，置紫外光灯254nm下检视。结果供试品在与对照药材色谱相应的位置上显相同的深蓝色斑点，阴性样品在此位置无干扰。见图3。
2-2 高良姜素的含量测定[1]附录34，[4]
2-2-1 色谱条件 色谱柱：Theromo BDS Hypersil C18 柱（250mm×4-6 mm，5μm）；流动相：甲醇-0-2%磷酸溶液（60∶ 40，V/V）；检测波长：266nm；柱温：31℃，理论塔板数按高良姜素计算应不低于6000。
2-2-2 对照品溶液的制备 精密称取高良姜素对照品4-05mg，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到0-405mg/ml对照品储备液。精密吸取对照品储备液1ml，置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，得40-5μg/ml对照品溶液。
2-2-3 供试品溶液的制备 取疏肝和胃颗粒研细（过80目筛），精密称取粉末6-0g，置于250ml锥形瓶中，加甲醇溶液100ml，称定重量，回流提取60min，放至室温，用甲醇补足减失的甲醇，摇匀，用微孔滤膜（0-45μm）滤过，取续滤液即得。
2-2-4 阴性对照品溶液的制备 取缺高良姜素的阴性对照样品6-0g，同供试品溶液制备方法制备阴性对照样品溶液。
2-2-5 系统适应性试验 取上述对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液在上述色谱条件下各进样20μl，测HPLC图谱。结果表明阴性样品在与对照品色谱相同位置处无干扰。见图4。
2-2-6 线性关系考察 分别吸取上述对照品溶液0-081、0-202、0-405、0-810、1-215、1-620μg注入高效液相色谱仪，记录峰面积，以峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归，得回归方程为Y=4254346X-9001（r=0-9999），表明高良姜素在0-081～1-62μg范围内线性关系良好。回归曲线见图5。
2-2-7 精密度试验 取同一对照品溶液依法重复进样5次，每次进样20μl，测定峰面积。峰面积的RSD为1-12%，表明仪器的精密度良好。
2-2-8 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0-5、2、4、8、12、24h进样20μl，测定峰面积并计算延胡索乙素的RSD。结果RSD为1-93%，表明供试品溶液在24h内稳定。
2-2-9 重复性试验 取同一批样品共5份，按供试品溶液的制备方法制备溶液，按上述色谱条件测定，结果延胡索乙素平均含量为0-2727 mg/g，RSD为0-45%，表明重复性良好。
2-2-10 最低检测限 精密吸取上述对照品溶液适量，加流动相逐步稀释至色谱图中高良姜素的峰高为噪音的3倍（信噪比S/N≥3）。高良姜素的最低检测限为0-23 μg/ml。
2-2-11 回收率试验 精密称取已知含量（0-2694 mg/g）的疏肝和胃颗粒样品各6g，分别精密加入高良姜素对照品溶液（0-405mg/ml）4ml，照供试品溶液制备方法制备并依法测定，计算回收率。结果见表1。
表1 加样回收率试验结果
2-2-12 样品测定 精密称取5批不同批号的疏肝和胃颗粒样品，按供试品溶液的制备方法制备溶液，测定含量，结果见表2。
表2 样品含量测定结果
3 讨论
元胡的薄层色谱鉴别时，采用3%NaOH浸泡3秒，普通硅胶G薄层板，使元胡中的元胡索乙素以游离态展开，有效防止了斑点拖尾，提高了分离效果[5]。
元胡和大黄TCL鉴别，分别从温度（15、25、35℃）及薄板型号等方面考察了方法耐用性。结果斑点清晰，分离度良好，分离无明显差异，表明方法耐用性良好。
取高良姜素对照品溶液用紫外可见分光光度计于200～400nm处进行扫描，从紫外图谱中可见在266nm处有比较强的最大吸收，与有关参考文献[6]报道一致，故选择266nm为检测波长。
2010版《中华人民共和国药典》中高良姜素测定流动相比例为甲醇-0-2%磷酸溶液（55∶ 45）[1]270，但结果不理想，研究将流动相比例调至甲醇-0-2%磷酸溶液（60∶ 40），高良姜素達到基线分离。
经过5批样品高良姜素含量测定，高良姜素含量最低为0-2678mg/g，考虑到原料药材的含量差异及工艺稳定性，将高良姜素含量低限以样品最低值的65%作为含量低限，则疏肝和胃颗粒中高良姜素含量不得低于0-17mg/g。参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：22，130，241，270，附录34.
[2]刘光斌，李怀彪.大黄通气口服液的稳定性研究[J].西部中医药，2013，26（11）：25-29.
[3]刘光斌，李怀彪，谢六生，等.大黄通气口服液的质量标准研究[J].中国中医药信息杂志，2011，18（7）：47-49.
[4]司马义江·阿布都热西提，阿依努尔·阿木提. HPLC法测定维药罗补甫克比日丸中高良姜素的含量[J].中国民族民间医药，2014，23（23）：8-9.
[5]肖环贤，陈映良.和胃止痛胶囊中延胡索、吴茱萸的鉴别方法研究[J].中国民族民间医药，2010，19（5）：20-21.
[6]李智勇，孙冬梅.HPLC法测定高良姜中高良姜素和山奈素的含量[J].中华中医药杂志，2010，25（9）：1368-1370.
（收稿日期：2015-06-18）
【关键词】 疏肝和胃颗粒；质量标准；高良姜素；薄层色谱；高效液相色谱
【中图分类号】R286-0 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）18-0014-03
Research on the Quality Standard of Shugan Hewei Granules
MAO Heping ZOU Ganpeng LIU Guangbin*
Department of Pharmacy，jiugang Hospital，Jiayuguan 735100，China
Abstract：ObjectiveTo formulate the quality standard for Shugan Hewei granules.MethodsThe qualities of Yuanhu（Rhizoma Corydalis yanhusuo W.T.Wang），Dahuang（Radix et Rhizoma Rhei）and Xiangfu（Rhizoma Cyperus rotundus I）in the granules were identified by microscopic examination；Thenatures of Yuanhu， Dahuang and xiangfu were detected by layer chromatography（TLC）and the contents of it measured by HPLC were inertsil C18 column，（15mm×4-6mm，5μm）、methanol-0-2% H3PO4=60/40，v/v， as mobile phase，0-8ml/min as flow speed and wavelength 266nm. Results The result objectived by microscopy were obvious；The TLC spots developed were clear with efficient separating ability，which were negative noninterferencs with the characterstics of high specificity and satisfactory reproducibility；The linear relation between psoralen among 0-081μg/ml-1-62μg/ml（r=0-9999）was excellent；The average recoveries of psoralen and isopsoralen were 97-93% （RSD=1-18%，n=6）respectively。ConclusionTLC and HPLC are handy，safe and accurate for Shugan Hewei granules todetermine the quality。
Keywords：Shugan Hewei Granules；Quality Standard；Galangin；TLC；HPLC
疏肝和胃颗粒是酒钢医院的医院制剂，由高良姜、香附、白芍等7味药物组成，具有疏肝理气、温中和胃、控酸止痛之功效，临床常用于治疗肝胃失和所致的胃脘痛。研究采用薄层色谱法对元胡、大黄、香附进行鉴别，采用高效液相法（HPLC）测定高良姜素的含量，为全面有效控制疏肝和胃颗粒的质量提供实验依据。
1 仪器与材料
1-1 仪器 岛津LC-15C高效液相色谱仪（SPD-15C紫外检测器，LC solution15C色谱工作站）；分析天平（Sartorious）。
1-2 材料 高良姜素对照品（批号：111699-200501）、延胡索乙素对照品（批号：0726-200107）、大黄酸对照品（批号：110757-200206）、香附对照药材（批号121059-200706）均购于中国食品药品检定研究院；硅胶GF254薄层板、硅胶G薄层板、硅膠H薄层板均购于青岛海洋化工有限公司；自制疏肝和胃颗粒（批号：20120201、20120202、20120203、20120204、20120205、20120206）和阴性样品（酒钢医院制）；甲醇、磷酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2-1 TLC鉴别
2-1-1 元胡TLC鉴别[1]22 取疏肝和胃颗粒30g，加甲醇50ml，超声处理30min，0-45μm滤膜滤过，蒸干滤液；残渣加水10ml溶解，加浓氨试液调至碱性；用乙醚振摇提取3次，每次10ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，做为供试品。取阴性供试品（缺元胡）30g，同法制备阴性溶液。取延胡索乙素对照品5-1mg置于10ml容量瓶中，用甲醇定容，做为对照品溶液。按照薄层色谱法，取硅胶G薄层板用3%NaOH溶液浸泡3秒，105℃活化30min，置干燥器备用。吸取上述三种溶液各4～6μl，分别点于处理好的同一薄层板上，以甲苯-丙酮（9∶ 2）为展开剂展开，取出，晾干；然后置碘缸中约3min后取出，挥尽板上吸附的碘后，置紫外光灯365nm下检视。结果供试品在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性样品在此位置无干扰。见图1。 2-1-2 大黄TLC鉴别[1]130，[2-3] 取疏肝和胃颗粒3g，加甲醇20ml，超声处理30min，静置1h，0-45μm滤膜滤过，取滤液5ml蒸干；残渣加水10ml使溶解，加盐酸1ml，加热回流30min，立即冷却；用乙醚振摇提取2次，每次20ml，合并乙醚液，蒸干；残渣加三氯甲烷1ml使溶解，做为供试品。取阴性供试品（缺大黄）3g，同法制备阴性溶液。取大黄酸对照品5mg于5ml容量瓶中，用甲醇定容，做为对照品。按照薄层色谱法，吸取上述三种溶液各4μl，分别点于同一硅胶H薄层板上，以石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶ 6∶ 1）为展开剂展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视。结果供试品在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性样品在此位置无干扰。见图2。
2-1-3 香附的TLC鉴别[1]241 取疏肝和胃颗粒12g，加乙醚5ml，超声处理60min，滤纸滤过，滤液蒸干；残渣用乙酸乙酯5ml溶解，做为供试品。取阴性供试品（缺香附）12g，同法制备阴性溶液。取香附对照药材0-2568g，加乙醚20ml，超声处理60min，滤纸滤过，滤液挥干，加乙酸乙酯0-125ml溶解，做为对照药材溶液。按照薄层色谱法，取经105℃活化30min的硅胶GF254薄层板，吸取上述三种溶液各2μl，分别点于同一薄层板上，展开时薄层板与展开缸底部接近90°，以二氯甲烷为展开剂展开，取出，晾干，置紫外光灯254nm下检视。结果供试品在与对照药材色谱相应的位置上显相同的深蓝色斑点，阴性样品在此位置无干扰。见图3。
2-2 高良姜素的含量测定[1]附录34，[4]
2-2-1 色谱条件 色谱柱：Theromo BDS Hypersil C18 柱（250mm×4-6 mm，5μm）；流动相：甲醇-0-2%磷酸溶液（60∶ 40，V/V）；检测波长：266nm；柱温：31℃，理论塔板数按高良姜素计算应不低于6000。
2-2-2 对照品溶液的制备 精密称取高良姜素对照品4-05mg，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到0-405mg/ml对照品储备液。精密吸取对照品储备液1ml，置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，得40-5μg/ml对照品溶液。
2-2-3 供试品溶液的制备 取疏肝和胃颗粒研细（过80目筛），精密称取粉末6-0g，置于250ml锥形瓶中，加甲醇溶液100ml，称定重量，回流提取60min，放至室温，用甲醇补足减失的甲醇，摇匀，用微孔滤膜（0-45μm）滤过，取续滤液即得。
2-2-4 阴性对照品溶液的制备 取缺高良姜素的阴性对照样品6-0g，同供试品溶液制备方法制备阴性对照样品溶液。
2-2-5 系统适应性试验 取上述对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液在上述色谱条件下各进样20μl，测HPLC图谱。结果表明阴性样品在与对照品色谱相同位置处无干扰。见图4。
2-2-6 线性关系考察 分别吸取上述对照品溶液0-081、0-202、0-405、0-810、1-215、1-620μg注入高效液相色谱仪，记录峰面积，以峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归，得回归方程为Y=4254346X-9001（r=0-9999），表明高良姜素在0-081～1-62μg范围内线性关系良好。回归曲线见图5。
2-2-7 精密度试验 取同一对照品溶液依法重复进样5次，每次进样20μl，测定峰面积。峰面积的RSD为1-12%，表明仪器的精密度良好。
2-2-8 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0-5、2、4、8、12、24h进样20μl，测定峰面积并计算延胡索乙素的RSD。结果RSD为1-93%，表明供试品溶液在24h内稳定。
2-2-9 重复性试验 取同一批样品共5份，按供试品溶液的制备方法制备溶液，按上述色谱条件测定，结果延胡索乙素平均含量为0-2727 mg/g，RSD为0-45%，表明重复性良好。
2-2-10 最低检测限 精密吸取上述对照品溶液适量，加流动相逐步稀释至色谱图中高良姜素的峰高为噪音的3倍（信噪比S/N≥3）。高良姜素的最低检测限为0-23 μg/ml。
2-2-11 回收率试验 精密称取已知含量（0-2694 mg/g）的疏肝和胃颗粒样品各6g，分别精密加入高良姜素对照品溶液（0-405mg/ml）4ml，照供试品溶液制备方法制备并依法测定，计算回收率。结果见表1。
表1 加样回收率试验结果
2-2-12 样品测定 精密称取5批不同批号的疏肝和胃颗粒样品，按供试品溶液的制备方法制备溶液，测定含量，结果见表2。
表2 样品含量测定结果
3 讨论
元胡的薄层色谱鉴别时，采用3%NaOH浸泡3秒，普通硅胶G薄层板，使元胡中的元胡索乙素以游离态展开，有效防止了斑点拖尾，提高了分离效果[5]。
元胡和大黄TCL鉴别，分别从温度（15、25、35℃）及薄板型号等方面考察了方法耐用性。结果斑点清晰，分离度良好，分离无明显差异，表明方法耐用性良好。
取高良姜素对照品溶液用紫外可见分光光度计于200～400nm处进行扫描，从紫外图谱中可见在266nm处有比较强的最大吸收，与有关参考文献[6]报道一致，故选择266nm为检测波长。
2010版《中华人民共和国药典》中高良姜素测定流动相比例为甲醇-0-2%磷酸溶液（55∶ 45）[1]270，但结果不理想，研究将流动相比例调至甲醇-0-2%磷酸溶液（60∶ 40），高良姜素達到基线分离。
经过5批样品高良姜素含量测定，高良姜素含量最低为0-2678mg/g，考虑到原料药材的含量差异及工艺稳定性，将高良姜素含量低限以样品最低值的65%作为含量低限，则疏肝和胃颗粒中高良姜素含量不得低于0-17mg/g。参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：22，130，241，270，附录34.
[2]刘光斌，李怀彪.大黄通气口服液的稳定性研究[J].西部中医药，2013，26（11）：25-29.
[3]刘光斌，李怀彪，谢六生，等.大黄通气口服液的质量标准研究[J].中国中医药信息杂志，2011，18（7）：47-49.
[4]司马义江·阿布都热西提，阿依努尔·阿木提. HPLC法测定维药罗补甫克比日丸中高良姜素的含量[J].中国民族民间医药，2014，23（23）：8-9.
[5]肖环贤，陈映良.和胃止痛胶囊中延胡索、吴茱萸的鉴别方法研究[J].中国民族民间医药，2010，19（5）：20-21.
[6]李智勇，孙冬梅.HPLC法测定高良姜中高良姜素和山奈素的含量[J].中华中医药杂志，2010，25（9）：1368-1370.
（收稿日期：2015-06-18）