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新红细胞生成刺激蛋白(NESP)是一种复杂的糖蛋白类药物,主要用于治疗慢性肾衰引起的贫血,含有5个N-连接和1个O-连接的糖基化位点.本研究建立了液相色谱-串联质谱法分析NESP的肽质量指纹图谱和糖肽结构.采用胰蛋白酶将所有糖基化位点酶解成肽段,分别采用高效液相色谱(HPLC)及两性离子亲水相互作用色谱(ZIC-HILIC)分析.与HPLC相比,ZIC-HILIC对O-糖肽的分离效果较理想,质谱信号响应也更强.在此基础上,尝试采用ZIC-HILIC对非特异性蛋白酶链霉蛋白酶E(Pronase E)酶解肽段进行分析.根据MS/MS碎片信息,一共鉴定了3种类型的O-糖肽,其糖链组成为GalNAcGal (NeuAc)2、GalNAcGal (NeuAc)1和GalNAcGal.