【摘 要】
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目的构建天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表达载体,观察Caspase-3表达载体对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响.方法应用基因重组方法,建立重构型Caspase-3基因的真核表达系统pcDNA3.1-rev-Caspase-3质粒和野生型pcDNA3.1-Caspase-3质粒.将实验细胞分为3组:转染pcDNA3.1-rev-Caspase-3质粒组,转染pcDNA3.1-C
【机 构】
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中南大学湘雅二医院呼吸科,长沙,410011,,
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目的构建天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表达载体,观察Caspase-3表达载体对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响.
方法应用基因重组方法,建立重构型Caspase-3基因的真核表达系统pcDNA3.1-rev-Caspase-3质粒和野生型pcDNA3.1-Caspase-3质粒.将实验细胞分为3组:转染pcDNA3.1-rev-Caspase-3质粒组,转染pcDNA3.1-Caspase-3质粒组,转染pcDNA3.1质粒空白对照组.前2组用Caspase-3抑制剂DEVD-fmk干预.应用Caspase-3酶活性分析、流式细胞仪及甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测A549细胞Caspase-3酶活性变化及细胞凋亡和增殖情况.
结果(1) pcDNA3.1-rev-Caspase-3质粒组、pcDNA3.1-Caspase-3质粒组的A549细胞Caspase-3酶活性分别是(11.87±0.92)%、(5.34±0.38)% (t=16.02, P<0.01);用Caspase-3抑制剂DEVD-fmk干预后,pcDNA3.1-rev-Caspase-3质粒组酶活性为(7.04±0.48)%,仍明显高于野生型pcDNA3.1-Caspase-3质粒组的(4.51±0.20)%(t=11.86, P<0.01).(2)流式细胞分析结果显示,pcDNA3.1-rev-Caspase-3质粒组、pcDNA3.1-Caspase-3质粒组和pcDNA3.1质粒组的A549细胞凋亡率分别是(20.1±3.5)%、(7.8±2.8)%、(1.4±0.3)%,3组差异有统计学意义(F=44.01,P<0.01).(3)MTT比色检测显示pcDNA3.1-rev-Caspase-3质粒组、pcDNA3.1-Caspase-3质粒组和pcDNA3.1质粒组的A549细胞生存率分别是(35.7±1.1)%、(72.8±2.9)%、(85.4±4.8)%,转染pcDNA3.1-rev-Caspase-3质粒组生存率明显低于其他两组(F=375.07,P<0.01).
结论pcDNA3.1-rev-Caspase-3在A549细胞内有较强的自身活化能力,对Caspase-3抑制剂抵抗作用较强,可明显诱导A549细胞凋亡并抑制A549细胞生长.
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