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为建立快速、准确的检测牛呼吸道主要病原菌牛支原体(Mycoplasma bovis)、牛多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)及牛结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的方法,对牛支原体oppD基因序列、牛多杀性巴氏杆菌Pm-kmt基因序列、牛结核分枝杆菌IS6110基因序列分别设计特异性引物,对单一PCR检测方法进行优化后建立三重PCR检测方法.结果 表明:三重PCR的最佳扩增条件为94℃预变性10 min;94℃1 min,60℃50s,72℃1 min,循环30次;72℃延伸10 min°建立的三重PCR方法能对同一样本中的3种病原菌进行扩增,特异性强°牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌和牛结核分枝杆菌的最低检测DNA浓度分别为5.306×10-3 ng/ μL、3.075×10-2ng/μL和1.605×10-4ng/μL.建立的三重PCR方法临床检测牛支原体肺炎鼻拭子、牛结核分枝杆菌、结核菌素与单一PCR检测方法的阳性符合率为100％.三重PCR检测方法可用于牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌的单一和混合感染鉴别诊断,具有快速、准确、简便的特点.