【摘 要】
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目的观察慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)沉默DNA结合蛋白A(dbpA)基因对大肠癌细胞株SW620增殖的影响,探讨该基因的作用。方法实验分为3组:慢病毒干扰组(shRNA-dbp A 组)、非特异性序列组(CON组)和空白对照组(NC组)。制备dbpA-短发卡RNA(shRNA)慢病毒表达载体,聚合酶链反应(PCR)筛选阳性克隆,测序鉴定。转染SW620细胞48 h后,反转录-聚合酶链反应(R
【机 构】
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710068西安,陕西省人民医院/西安交通大学第三附属医院普外一科,710068西安,陕西省人民医院/西安交通大学第三附属医院普外一科,710068西安,陕西省人民医院/西安交通大学第三附属医院普外一
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目的观察慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)沉默DNA结合蛋白A(dbpA)基因对大肠癌细胞株SW620增殖的影响,探讨该基因的作用。
方法实验分为3组:慢病毒干扰组(shRNA-dbp A 组)、非特异性序列组(CON组)和空白对照组(NC组)。制备dbpA-短发卡RNA(shRNA)慢病毒表达载体,聚合酶链反应(PCR)筛选阳性克隆,测序鉴定。转染SW620细胞48 h后,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法对细胞中dbpA mRNA表达水平进行分析,Western blot检测SW620细胞的dbp A蛋白表达水平;同时采用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期变化,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖抑制率,并检测细胞克隆形成能力。
结果PCR和测序证实,成功构建shRNA-dbpA病毒表达载体,shRNA-dbpA显著下调了SW620细胞中dbpA的表达,所构建的重组慢病毒有较高的基因沉默效率,Western blot检测结果表明shRNA-dbpA组的dbpA表达水平下调。流式细胞仪检测各组的凋亡率分别为(26.60±0.38)%、(12.54±0.25)%和(4.46±0.19)%,shRNA-dbpA组显著高于其他两组(P<0.01),且G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,G2/M期细胞增多(P< 0.05);MTT法检测结果显示各组的增殖第5天吸光度值分别为1.183±0.226、5.295±0.282和10.207±0.383,shRNA-dbpA组显著低于其他两组(P< 0.01);细胞克隆数分别为(37±3)、(64±5)和(175±10)个,shRNA-dbpA组显著低于于其他两组(P< 0.01)。
结论以dbpA为靶标的RNA干扰能下调大肠癌细胞株SW620中的dbpA表达,显著增加细胞的凋亡,阻滞细胞于G0/G1期,降低了细胞的增殖克隆能力。
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