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摘要 [目的]采用长期纳米氧化锌腹腔内注射，初步测定纳米氧化锌颗粒对小鼠一般状态、肺及炎症介质的慢性影响。[方法] 取25 g左右健康小鼠22只，雌雄各半，随机分为空白对照组和试验组，每组11只。试验组小鼠给予腹腔注射83 mg/ml纳米氧化锌悬浊液各0.15 ml，连续注射7 d，对照注射等量生理盐水，注射药物结束3 d后观察小鼠一般状态并取材，肺叶称重测定湿干比（W/D），采用HE染色在光学显微镜下观察肺组织形态。采用ELISA法检测支气管肺泡灌洗液及血清中细胞间粘附分子1（ICAM1）和肿瘤坏死因子α（TNFα）含量。 [结果] 与对照组小鼠相比，试验组小鼠死亡率增加，平均体重明显减轻，肺的湿干比增高；血清及灌洗液中炎症因子TNFα及ICAM1 含量显著升高，存在显著性差异（P<0.05）；显微镜下可见肺组织有损伤。 [结论] 长期纳米氧化锌腹腔注射可对小鼠肺产生慢性不良影响。
关键词 纳米氧化锌；ICAM1；TNFα
中图分类号 S181；R994.6 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）31-10976-03
Chronic Effects of Nano Zinc Oxide in Mice
WANG Qunlin1， LI Yan2， XU Cong3， ZHANG Xiaohua3* et al （1. Department of Clinical Medicine， Binzhou Medical college， Yantai 264003；2.Respiratory Department，Affiliated Hospital of Binzhou Medical College，Binzhou，Shandong 256603；3.College of Pharmacy，Binzhou Medical College，Yantai，Shandong 264003）
Abstract [Objective] By longterm intraperitoneal injection of nanozinc oxide， preliminary determine chronic effects of nanozinc oxide particles on the general state of the mice， changes of liver and lung， and inflammatory mediators. [Method] Taking 22 healthy mice weighed about 25 g which were randomly divided into two groups， control group and the experimental group， 11 mice per group. The mice in experimental group were intraperitoneally injected nanozinc oxide suspension（0.83 mg / ml， 0.15ml） for 7 days， and the mice in control group were disposed of saline injection. 3 days after the end of injection， the general state of the mice was observed and specimens were drawn， lung weighing measured W/D. ELISA was used to test the content of intercellular adhesion molecule 1 （ICAM1） and tumor necrosis factorα （TNFα） in the bronchoalveolar lavage fluid and serum. Liver and lung tissue was obtained by means of anatomy and then stained with HE， morphology was observed under the microscope. [Result] Compared with the mice in control group， mice in the experimental group had increased mortality， significantly reduced average， weight W/D significantly increased； inflammatory cytokine TNFα and ICAM1 content in serum and lavage fluid were significantly increased， and the results are statistically significant （P<0.05）； liver and lung tissue damage could be visible in varying degrees under the optical microscope. [Conclusion] Longterm intraperitoneal injection of nanozinc oxide can produce chronic adverse effects on mice.
Key words Nano Zinc Oxide； ICAM1； TNFα
纳米氧化锌为一种新型无机多功能材料，是粒径介于1～100 nm的金属氧化物微粒[1]。由于纳米氧化锌具有特殊优异的性能[2]，使其在许多研究领域具有重要应用价值和广阔應用前景。目前，纳米氧化锌已被广泛应用于纺织[3]、化妆品[4]和医药等领域，不可避免地进入自然环境和生命体中[5-6]，但其安全性一直广受争议。研究表明，纳米材料对人类身体健康和周围生态系统可能造成潜在危害，随着纳米毒理学的兴起和发展，纳米氧化锌的生物安全性被相关领域学者关注[7]。笔者利用小鼠腹腔注射纳米氧化锌，通过观察小鼠一般状况（存活率、体重）和肺湿干质量比，观察小鼠肺组织形态学改变，检测支气管肺泡灌洗液及血清中ICAM1和TNFα含量变化，以探索纳米氧化锌对小鼠肺毒性的影响。 1 材料与方法
1.1 实验动物 清洁级健康昆明小鼠，6～8周龄，体重（25±2）g，雌雄各半，购自烟台绿叶制药有限公司。
1.2 试验试剂 纳米氧化锌，购自Sigma公司（货号96479），临用前配制浓度83 mg/ml悬浊液；生理盐水，购自滨州医学院；细胞间粘附分子1（ICAM1）及肿瘤坏死因子α（TNFα）的ELISA试剂盒，购自上海太阳生物技术有限公司；其他试剂，均为分析纯，购自商业试剂公司。
1.3 动物分组及处理 取25 g左右健康昆明小鼠22只，将其随机分为空白对照组和试验组，并用电子秤称取各小鼠试验前体重。饲养3 d后，给予试验组小鼠腹腔注射0.15 ml已配制纳米ZnO悬浊液。空白对照组注射0.15 ml生理盐水。连续注射7 d。
1.4 小鼠一般情况观察 观察包括生存状态、生存率和体重改变，注射7 d后继续饲养3 d，然后抓取小鼠称重并麻醉、解剖和取材。
1.5 肺组织病理切片HE染色 各组小鼠腹腔注射生理盐水或纳米ZnO悬浊液后3 d，眼球取血并处死小鼠，开胸取右肺上叶，修剪为小块，迅速固定于4%甲醛溶液中，72 h后进行石蜡切片及常规HE染色，光学显微镜下观察肺组织病理改变。
1.6 肺组织湿/干质量（W/D）比值 每组小鼠处死后，取全肺，称湿重，然后将小鼠肺置于60 ℃恒温箱中干燥，72 h后取出称干重，计算肺W/D比值。
1.7 血液及灌洗液炎症因子检测 采用ELISA法检测支气管肺泡灌洗液及血清中细胞间粘附分子1（ICAM1）和肿瘤坏死因子α（TNFα）含量。小鼠眼球取血，静置30 min后，3 000 r/min 离心10 min，上清冻存待检。解剖颈部和胸部，气管和右侧肺叶结扎，左侧肺部灌洗，用穿刺针插入气管上端，0.5 ml生理盐水（NS）反复冲洗3遍，3 000 r/min 离心10 min，取上清冻存待检。按照ELISA试剂盒说明书（上海太阳生物技术有限公司）操作，每个样本重复3次。
2 结果与分析
2.1 小鼠一般生存状况观察和存活率比较 观察试验过程中对照组小鼠精神状态良好，活动自如，摄食、饮水无明显异常，毛发光亮，反应灵敏；注射纳米氧化锌试验组小鼠出现精神不佳，蜷缩成团，摄食、饮水减少，反应迟钝，活动减少。与正常对照组相比，试验组小鼠存活率降低（表1）。
3 结论与讨论
纳米氧化锌可以通过口服、吸入、注射或者皮肤渗透等途径进入人体，对人体的各个系统产生影响。据报道，纳米氧化锌颗粒可对人体正常细胞有毒性作用，如可损伤单核细胞系、肺腺癌细胞系、肺成纤维细胞、肝细胞等[8-10]。吴诚等[11]采用孙氏改良寇氏法诱发小鼠急性毒试验，配制6个梯度的纳米氧化锌药液以灌胃方式一次性供给试鼠。结果表明，高剂量纳米氧化锌可对小鼠的肾脏、小肠、肺脏和肝脏等组织器官造成广泛性损伤，并引起严重的瘀血、出血、细胞变性坏死、大量细胞核固缩碎裂等病理变化。Liu等[12] 报道3种纳米材料（氧化锌、银、二氧化钛）气管灌注大鼠后均可引起肺部氧化应激损伤。笔者利用纳米氧化锌腹腔内注射小鼠，初步探讨纳米氧化锌颗粒对小鼠肺组织及炎症介质的影响。结果表明，对照组相比，注射纳米氧化锌小鼠生存状态变差、存活率降低、体重减轻，肺的湿干比增高，肺组织出现一定程度损伤，血清、肺泡灌洗液中TNFα 及ICAM1含量明显升高。综上所述，纳米氧化锌对小鼠产生一定毒性作用，导致小鼠生存状态、肺组织形态学发生改变，同时纳米氧化锌可刺激小鼠机体产生炎性反应，促使炎症因子TNFα 及ICAM1 含量明显升高。纳米氧化锌通过如何机制导致肺损伤是今后进一步研究方向。
参考文献
[1]
DU Y，ZANG M S，HONG J，et al.Structural and optical properties of nanophase zinc oxide[J].Applied Physics A，2003，76：171-176.
[2] 趙玉岭.纳米材料性质及应用[J].煤炭科技，2009，28（8）：149-151.
[3] 周少余，徐水凌，朱逢佳，等.纳米氧化锌海丝纤维的抗菌和细胞毒性作用[J].上海纺织科技，2009，37（12）：5-7.
[4] 吕瑛，谢嘉颖.防晒剂中纳米氧化锌的安全性研究进展[J].中国化妆品（行业版），2011（5）：62-65.
[5] 王发园.人工纳米颗粒的植物毒性及其在植物中的吸收和累积[J].生态毒理学报，2012，7（2）：140-147.
[6] 朱小山，朱琳，田胜艳，等.三种金属氧化物纳米颗粒的水生态毒性[J].生态学报，2008，28（8）：3507-3516.
[7] 宋文华，张金洋，高敏苓，等.纳米氧化锌对小鼠的急性毒性效应研究[C]//2008年全国纳米生物和医学学术会议论文集.中国纳米技术学会，江苏省生物医学工程学会，中国生物医学工程学会，2008：196-198.
[8] 刘佳蕙，杨胜韬，王海芳，等.纳米氧化锌对人单核细胞系U937的毒性及其机制研究[J].中华预防医学杂志，2010，44（9）：790-794.
[9] 王琳，王莉娟，张芳，等.纳米氧化锌对人肺腺癌细胞A549的毒性[J].中国科学院研究生院学报，2009，26（1）：83-90.
[10] 刘鹏鹏，关荣发，程歌，等.纳米氧化锌对人正常肝细胞HL-7702的毒性作用研究[J].安徽农业科学，2009，37（36）：18023-18026.
[11] 吴诚，文利新，袁慧，等.纳米氧化锌对小鼠的毒性试验[J].粮食与饲料工业，2008（5）：38-39.
[12] LIU H，YANG D，YANG H，et al.Comparative study of respiratory tract immune toxicity induced by three sterilisation nanoparticles：silver，zinc oxide and titanium dioxide[J].J Hazard Mater，2013，248/249：478-486.
关键词 纳米氧化锌；ICAM1；TNFα
中图分类号 S181；R994.6 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）31-10976-03
Chronic Effects of Nano Zinc Oxide in Mice
WANG Qunlin1， LI Yan2， XU Cong3， ZHANG Xiaohua3* et al （1. Department of Clinical Medicine， Binzhou Medical college， Yantai 264003；2.Respiratory Department，Affiliated Hospital of Binzhou Medical College，Binzhou，Shandong 256603；3.College of Pharmacy，Binzhou Medical College，Yantai，Shandong 264003）
Abstract [Objective] By longterm intraperitoneal injection of nanozinc oxide， preliminary determine chronic effects of nanozinc oxide particles on the general state of the mice， changes of liver and lung， and inflammatory mediators. [Method] Taking 22 healthy mice weighed about 25 g which were randomly divided into two groups， control group and the experimental group， 11 mice per group. The mice in experimental group were intraperitoneally injected nanozinc oxide suspension（0.83 mg / ml， 0.15ml） for 7 days， and the mice in control group were disposed of saline injection. 3 days after the end of injection， the general state of the mice was observed and specimens were drawn， lung weighing measured W/D. ELISA was used to test the content of intercellular adhesion molecule 1 （ICAM1） and tumor necrosis factorα （TNFα） in the bronchoalveolar lavage fluid and serum. Liver and lung tissue was obtained by means of anatomy and then stained with HE， morphology was observed under the microscope. [Result] Compared with the mice in control group， mice in the experimental group had increased mortality， significantly reduced average， weight W/D significantly increased； inflammatory cytokine TNFα and ICAM1 content in serum and lavage fluid were significantly increased， and the results are statistically significant （P<0.05）； liver and lung tissue damage could be visible in varying degrees under the optical microscope. [Conclusion] Longterm intraperitoneal injection of nanozinc oxide can produce chronic adverse effects on mice.
Key words Nano Zinc Oxide； ICAM1； TNFα
纳米氧化锌为一种新型无机多功能材料，是粒径介于1～100 nm的金属氧化物微粒[1]。由于纳米氧化锌具有特殊优异的性能[2]，使其在许多研究领域具有重要应用价值和广阔應用前景。目前，纳米氧化锌已被广泛应用于纺织[3]、化妆品[4]和医药等领域，不可避免地进入自然环境和生命体中[5-6]，但其安全性一直广受争议。研究表明，纳米材料对人类身体健康和周围生态系统可能造成潜在危害，随着纳米毒理学的兴起和发展，纳米氧化锌的生物安全性被相关领域学者关注[7]。笔者利用小鼠腹腔注射纳米氧化锌，通过观察小鼠一般状况（存活率、体重）和肺湿干质量比，观察小鼠肺组织形态学改变，检测支气管肺泡灌洗液及血清中ICAM1和TNFα含量变化，以探索纳米氧化锌对小鼠肺毒性的影响。 1 材料与方法
1.1 实验动物 清洁级健康昆明小鼠，6～8周龄，体重（25±2）g，雌雄各半，购自烟台绿叶制药有限公司。
1.2 试验试剂 纳米氧化锌，购自Sigma公司（货号96479），临用前配制浓度83 mg/ml悬浊液；生理盐水，购自滨州医学院；细胞间粘附分子1（ICAM1）及肿瘤坏死因子α（TNFα）的ELISA试剂盒，购自上海太阳生物技术有限公司；其他试剂，均为分析纯，购自商业试剂公司。
1.3 动物分组及处理 取25 g左右健康昆明小鼠22只，将其随机分为空白对照组和试验组，并用电子秤称取各小鼠试验前体重。饲养3 d后，给予试验组小鼠腹腔注射0.15 ml已配制纳米ZnO悬浊液。空白对照组注射0.15 ml生理盐水。连续注射7 d。
1.4 小鼠一般情况观察 观察包括生存状态、生存率和体重改变，注射7 d后继续饲养3 d，然后抓取小鼠称重并麻醉、解剖和取材。
1.5 肺组织病理切片HE染色 各组小鼠腹腔注射生理盐水或纳米ZnO悬浊液后3 d，眼球取血并处死小鼠，开胸取右肺上叶，修剪为小块，迅速固定于4%甲醛溶液中，72 h后进行石蜡切片及常规HE染色，光学显微镜下观察肺组织病理改变。
1.6 肺组织湿/干质量（W/D）比值 每组小鼠处死后，取全肺，称湿重，然后将小鼠肺置于60 ℃恒温箱中干燥，72 h后取出称干重，计算肺W/D比值。
1.7 血液及灌洗液炎症因子检测 采用ELISA法检测支气管肺泡灌洗液及血清中细胞间粘附分子1（ICAM1）和肿瘤坏死因子α（TNFα）含量。小鼠眼球取血，静置30 min后，3 000 r/min 离心10 min，上清冻存待检。解剖颈部和胸部，气管和右侧肺叶结扎，左侧肺部灌洗，用穿刺针插入气管上端，0.5 ml生理盐水（NS）反复冲洗3遍，3 000 r/min 离心10 min，取上清冻存待检。按照ELISA试剂盒说明书（上海太阳生物技术有限公司）操作，每个样本重复3次。
2 结果与分析
2.1 小鼠一般生存状况观察和存活率比较 观察试验过程中对照组小鼠精神状态良好，活动自如，摄食、饮水无明显异常，毛发光亮，反应灵敏；注射纳米氧化锌试验组小鼠出现精神不佳，蜷缩成团，摄食、饮水减少，反应迟钝，活动减少。与正常对照组相比，试验组小鼠存活率降低（表1）。
3 结论与讨论
纳米氧化锌可以通过口服、吸入、注射或者皮肤渗透等途径进入人体，对人体的各个系统产生影响。据报道，纳米氧化锌颗粒可对人体正常细胞有毒性作用，如可损伤单核细胞系、肺腺癌细胞系、肺成纤维细胞、肝细胞等[8-10]。吴诚等[11]采用孙氏改良寇氏法诱发小鼠急性毒试验，配制6个梯度的纳米氧化锌药液以灌胃方式一次性供给试鼠。结果表明，高剂量纳米氧化锌可对小鼠的肾脏、小肠、肺脏和肝脏等组织器官造成广泛性损伤，并引起严重的瘀血、出血、细胞变性坏死、大量细胞核固缩碎裂等病理变化。Liu等[12] 报道3种纳米材料（氧化锌、银、二氧化钛）气管灌注大鼠后均可引起肺部氧化应激损伤。笔者利用纳米氧化锌腹腔内注射小鼠，初步探讨纳米氧化锌颗粒对小鼠肺组织及炎症介质的影响。结果表明，对照组相比，注射纳米氧化锌小鼠生存状态变差、存活率降低、体重减轻，肺的湿干比增高，肺组织出现一定程度损伤，血清、肺泡灌洗液中TNFα 及ICAM1含量明显升高。综上所述，纳米氧化锌对小鼠产生一定毒性作用，导致小鼠生存状态、肺组织形态学发生改变，同时纳米氧化锌可刺激小鼠机体产生炎性反应，促使炎症因子TNFα 及ICAM1 含量明显升高。纳米氧化锌通过如何机制导致肺损伤是今后进一步研究方向。
参考文献
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[5] 王发园.人工纳米颗粒的植物毒性及其在植物中的吸收和累积[J].生态毒理学报，2012，7（2）：140-147.
[6] 朱小山，朱琳，田胜艳，等.三种金属氧化物纳米颗粒的水生态毒性[J].生态学报，2008，28（8）：3507-3516.
[7] 宋文华，张金洋，高敏苓，等.纳米氧化锌对小鼠的急性毒性效应研究[C]//2008年全国纳米生物和医学学术会议论文集.中国纳米技术学会，江苏省生物医学工程学会，中国生物医学工程学会，2008：196-198.
[8] 刘佳蕙，杨胜韬，王海芳，等.纳米氧化锌对人单核细胞系U937的毒性及其机制研究[J].中华预防医学杂志，2010，44（9）：790-794.
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[10] 刘鹏鹏，关荣发，程歌，等.纳米氧化锌对人正常肝细胞HL-7702的毒性作用研究[J].安徽农业科学，2009，37（36）：18023-18026.
[11] 吴诚，文利新，袁慧，等.纳米氧化锌对小鼠的毒性试验[J].粮食与饲料工业，2008（5）：38-39.
[12] LIU H，YANG D，YANG H，et al.Comparative study of respiratory tract immune toxicity induced by three sterilisation nanoparticles：silver，zinc oxide and titanium dioxide[J].J Hazard Mater，2013，248/249：478-486.