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摘要：样品经过提取，经色谱柱分离，流动相梯度洗脱，多反应监测模式进行检测。考察称量、标准溶液配制、标准曲线拟合、测量重复性等主要因素引入的不确定度，并对不确定度的各分量进行计算和合成。实验过程中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的不确定度为0.31μg/kg。
关键词：不确定度;脱氧雪腐镰刀菌烯醇;大米;高效液相色谱-串联质谱法
绪论
脱氧雪腐镰刀菌烯醇是一种真菌毒素，主要由禾谷镰刀菌、雪腐镰刀菌、尖孢镰刀菌等镰刀菌产生[1]。该毒素具有较强的细胞毒性和胚胎毒性，也具有一定的致畸致癌性，对免疫系统也有影响，人或畜食用被该毒素污染的粮食或饲料后可能对其健康产生严重危害。因此中GB2761-2019中增加了脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测限量标准[2，3]。
脱氧雪腐镰刀菌烯醇化学性质稳定，蒸煮及食物加工都不能破坏其毒性，近年来的跟踪监测检出率较高，危害性不容忽视。检测方法主要是（GC-MS）、（HPLC）和（HPLC-MS），HPLC法干扰较多，定性能力不强，GC-MS前处理需要衍生，相较而言，超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）具有更高分离和抗干扰能力，优势明显，应用最为广泛。
脱氧雪腐镰刀菌烯醇通过高效液相色谱-串联质谱法进行检测[3]，检测过程中受实验环境、仪器设备、人员操作等因素的影响，测量会不可避免的引入一定的不确定度[4]。不确定度是利用可获得的信息，表征赋予被测量量值分散性的非负参数[5]，其数值大小反映了测量结果质量的高低，可用于评价定量分析结果的准确性，为不同测试机构实现数据互认提供参考，因此评定测量不确定度对于保证测量结果的准确性非常重要[6～8]。本研究参考JJF10591.1-2012《测量不确定度评定与表示》、CNAS-GL006《化学分析中不确定度的评估指南》[9]和GB/T27418-2017《测量不确定度评定和表示》[5]等对液质联用检测大米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的不确定度进行分析，以期为脱氧雪腐镰刀菌烯醇的准确检测提供参考。
一、测试方法简述
1、提取及净化
称取样品2g（精确至0.001g），用乙腈水溶液提取，涡旋，超声，离心，取上清液净化，净化液用氮气吹干，乙腈/乙酸铵定容1.00mL，过膜，待液相色谱串联质谱分析。采用样品加标实验评定方法的不确定度。分别吸取样液进样，测得其峰面积，代入标准系列的一元线性回归方程中求得样液中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量。
2、仪器条件
（1）液相色谱条件：
色谱柱：ZORBAXEclipsePlusC183.0*100mm，1.8μm;
流速：0.4mL/min;进样量：10.0μL;柱温：40℃;
液相色谱梯度洗脱程序见表2-1。
（2）质谱条件
电离方式：电喷雾离子源，负离子模式ESI-;MRM
毛细管电压：3.0kV;喷嘴电压：0.5kV;离子源温度：100℃;脱溶剂气及鞘气：N2;脱溶剂气温度：350℃;脱溶剂气流量：360L/h;脱溶剂气压力：40psi;碰撞气：高纯N2;
保留时间、监测离子对、去簇电压及碰撞能量见表2-2。
3、计算公式
试样中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量按下式进行计算
二、不确定度的来源分析及测量数学模型的建立
从测量过程和数学模型分析，样品测定的不确定度来源有：标准溶液配制引入的不确定度urel（C）;标准曲线校准引入的不确定度urel（X0）;样品称量引入的不确定度urel（m）;样品溶液添加、稀释和定容引入的不确定度urel（V）;结果重复性引入的不确定度urel（frep）。
不确定度数学模型：
三、不确定度评定
1、标准溶液配制引入的不确定度
标准溶液配制包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液的配制和13C15-脱氧雪腐镰刀菌烯醇内标溶液的配制，因此标准溶液的相对标准不确定度为：
（1）标准溶液引入的不确定度
脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓度为200.3±6.2μg/mL、13C15-脱氧雪腐镰刀菌烯醇内标溶液浓度为25.0±0.2μg/mL，按正态分布置信概率P=95%，包含因子k=2，
（2）外标溶液配制、稀释引入的不确定度
标准品配制所使用的10mLA级容量瓶20℃时的容量允差为±0.020mL，服从三角分布，区间半宽度a（V10）=0.020ml*k=，由此引起的标准不确定度u1（V10）=a（V10）/k=0.020/=0.00817，实验室温度在（20±5）℃之间变动，甲醇的膨胀系数（20℃）为0.000118/℃，对10ml容量瓶由温度效应产生的体積变化为10*5*0.000118=0.059ml，服从均匀分布，k=，由此引起的不确定度u2（V10）=a/k=0.59/=0.0341mL，故u（V10）==0.0351，其相对标准不确定度urel（V1）=u（V10）/V10=0.00351。
标准溶液稀释引入的不确定度：标准溶液稀释使用200μl移液枪，其容量允差为±2.0μl，服从均匀分布，k=，由此引起的不确定度u1（V200）=a1（V200）/k=2.0/=1.15μL;由温度效应产生的体积变化分别为200*5*0.00115=1.18μl，服从均匀分布，k=，u2（V200）=1.18/=0.682μl，故稀释过程中移液枪使用引入的标准不确定度为u（V200）==1.34μL，稀释过程中用到10mLl容量瓶1次，移液枪50μL（DON）一次，故标准溶液稀释过程引入的相对标准不确定度为：
由此，标准溶液配制、稀释过程引入的相对标准不确定度为： 综上所述，外标溶液引入的相对标准不确定度为：
相关结果见表3-1。
（3）内标物引入的不确定度
内标物浓度引入的不确定度：内标溶液配制、稀释、添加引入的不确定度计算与外标的计算方法相同，其值为urel（V1）=u（V10）/V10=0.00351;实验过程中内标溶液的添加是用200μL移液枪（2次），故内标溶液稀释引入的不确定为urel（V2）==0.010，实验过程中，内标溶液的添加使用200μl移液枪，移液枪引入的标准不确定度为urel（V200）=1.35μL，样品前处理过程中内标溶液移取体积为20μL，故内标溶液添加引入的相对标准不确定度为urel（V3）=1.35/20=0.0675。由此内标配制、稀释、添加过程引入的相对标准不确定度为urel（V）===0.0683，故13C15-脱氧雪腐镰刀菌烯醇内标溶液引入的相对标准不确定度为urel（Cistd）==0.0684。
2、最小二乘法拟合引入的不确定度
试验中，配制6个浓度的校准溶液：1.0ng/mL，2.0ng/mL，5.0ng/mL，10.0ng/mL，20.0ng/mL，50.0ng/mL（其中含内标物13C15-脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓度均为10.0ng/mL），外标与内标的质量浓度比X0分别为0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00的6个标准溶液测定一次，得到内外标峰面积比值y，对以上测定数据采用最小二乘法进行拟合，得到校准曲线方程y=ax+b和拟合系数r2，相关结果见表3-2。
为了评定最小二乘法估计量的不确定度，首先必须对直接测量所得的测量数据进行不确定度评估，实际上就是求出测量数据的实验标准差：
公式中为当输入量为xj时，仪器响应值与拟合直线上对应的相应值之差。
在用间接式测量仪器测量时，利用校准曲线，在测量样品响应值y0后，可以按照线性回归方程计算被测量的预估值x0，其标准不确定度u（x0）为：
公式中s（y）为校准溶液峰面积比残差的标准偏差，b为拟合直线的斜率，p为样品平行测量的次数（p=6），n为拟合直线的数据总数（n=6），x0为样品平行测量p次结果的平均值，为绘制拟合直线全部输入值xi的总平局值，urel（x0）=u（x0）/x0，计算结果见表3-5。
3、样品称样量引入的不确定度
样品称样量使用万分之一天平准确称取，天平最大允许误差为±0.1mg，按均匀分布考虑，包含因子k=，不确定度为urel（m）=0.0001/=0.000003。
样品溶液添加、稀释和样品定容引入的不确定度：
样品溶液添加引入：实验过程中提取液的添加使用10ml移液器，根据JJG646-2006的规定，容量允差为±0.6%，服从均匀分布，k=，u1（V10）=10000a（V10）/k=0.00346ml，由温度效应产生的体积变化为10*5*0.00137=0.0685ml，服从均匀分布u2（V10）=0.0395ml，即urel（V1）=/10=0.00397。
样品溶液稀释引入的不确定度：实验过程中，氮吹浓缩5ml样品溶液使用10ml移液器，容量允差为±0.6%，服从均匀分布，k=，u1（V10）=5000a（V10）/k=0.00173ml，由温度效应产生的体积变化为5*5*0.00137=0.0342ml，服从均匀分布u2（V10）=0.0197ml，即urel（V2）=/5=0.00685。
定容体积引入的不确定度：样品定容使用1ml移液器，容量允许差为±1.0%，服从均匀分布，u1（V1000）=1000*1.0%/=5.774μl，实验室温度引起的体积变化可以忽略不计，故urel（V3）=5.774/1000=0.00577。
综上所述，样品溶液添加、稀释和定容引入的不确定度为urel（V）==0.00980。
结果重复性引入的不确定度：在重复性条件下对4ng进行了6次独立测试，平行测试结果和平均值见表3-6，根据贝塞尔公式计算的单次测量的标准不确定度：u（X）=s（X）=（3-8）
以多次测量结果的算术平均值为最佳估算值，则测定结果的标准不确定度为：u（）=s（）/（3-9）
由此结果重复性引入的相对标准不确定度：
结果见下表。
4、样品合成标准不确定度
样品中目标化合物的相对标准不确定度为：
合成标准不确定度u（x）=x*urel，取包含因子k=2，置信概率p=95%，则扩展不确定度为U（x）=k*u（x）。
四 结论
本文采用液相色谱串联质谱法对大米中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇进行测定，比较各分量不确定度的大小发现实验过程中标准溶液的配制带来的不确定度影响最大。该方法准确可靠，整个实验过程中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的不确定度分别为0.31μg/kg，为检测过程中脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测结果的准确性提高提供技术指导。
参考文献
[1]刘静，何立英，刘亚敏.脱氧雪腐镰刀菌烯醇的细胞毒性作用研究进展[J].武警医学院学报，2008，17（1）：68-70.
[2]金秀娟，朱旭东.脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其检测[J].粮油仓储科技通讯，2010，26（1）：47-49.
[3]王丽娟，柯润辉，安红梅，等.固相萃取柱净化-液相色谱-串联质谱法测定糕点中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物和玉米赤霉烯酮[J].食品工业科技，2017，38（14）：31-34，50.
[4]高家敏，曹進，丁宏.超高效液相色谱-串联质谱法测定化妆品中地塞米松含量的不确定度分析[J].中国药师，2018，21（3）：539-542，546.
[5]GB/T27418-2017测量不确定度评定和表示[S].中国标准出版社，2017.
[6]谢焕山，卢浩扬，陈雨晴，等.高效液相色谱-串联质谱法测定人血清中文拉法辛和O-去甲基文拉法辛的不确定度评价[J].中国医院药学杂志，2019，39（14）：1454-1459.
[7]吾建祥，杨德毅，刘莉，等.高效液相色谱-串联质谱法测定茭白中甲氨基阿维菌素苯甲酸盐残留量的不确定度评价[J].食品安全质量检测学报，2018，9（9）：2106-2112.
[8]晁伟杰.高效液相色谱-串联质谱法测定鲫鱼中孔雀石绿的不确定度评定[J].食品安全质量检测学报，2019，10（15）：5190-5195.
[9]CNAS-GL006化学分析中不确定度的评估指南[S].中国合格评定国家认可委员会，2019.
谱尼测试集团股份有限公司 北京市海淀区 100194
关键词：不确定度;脱氧雪腐镰刀菌烯醇;大米;高效液相色谱-串联质谱法
绪论
脱氧雪腐镰刀菌烯醇是一种真菌毒素，主要由禾谷镰刀菌、雪腐镰刀菌、尖孢镰刀菌等镰刀菌产生[1]。该毒素具有较强的细胞毒性和胚胎毒性，也具有一定的致畸致癌性，对免疫系统也有影响，人或畜食用被该毒素污染的粮食或饲料后可能对其健康产生严重危害。因此中GB2761-2019中增加了脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测限量标准[2，3]。
脱氧雪腐镰刀菌烯醇化学性质稳定，蒸煮及食物加工都不能破坏其毒性，近年来的跟踪监测检出率较高，危害性不容忽视。检测方法主要是（GC-MS）、（HPLC）和（HPLC-MS），HPLC法干扰较多，定性能力不强，GC-MS前处理需要衍生，相较而言，超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）具有更高分离和抗干扰能力，优势明显，应用最为广泛。
脱氧雪腐镰刀菌烯醇通过高效液相色谱-串联质谱法进行检测[3]，检测过程中受实验环境、仪器设备、人员操作等因素的影响，测量会不可避免的引入一定的不确定度[4]。不确定度是利用可获得的信息，表征赋予被测量量值分散性的非负参数[5]，其数值大小反映了测量结果质量的高低，可用于评价定量分析结果的准确性，为不同测试机构实现数据互认提供参考，因此评定测量不确定度对于保证测量结果的准确性非常重要[6～8]。本研究参考JJF10591.1-2012《测量不确定度评定与表示》、CNAS-GL006《化学分析中不确定度的评估指南》[9]和GB/T27418-2017《测量不确定度评定和表示》[5]等对液质联用检测大米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的不确定度进行分析，以期为脱氧雪腐镰刀菌烯醇的准确检测提供参考。
一、测试方法简述
1、提取及净化
称取样品2g（精确至0.001g），用乙腈水溶液提取，涡旋，超声，离心，取上清液净化，净化液用氮气吹干，乙腈/乙酸铵定容1.00mL，过膜，待液相色谱串联质谱分析。采用样品加标实验评定方法的不确定度。分别吸取样液进样，测得其峰面积，代入标准系列的一元线性回归方程中求得样液中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量。
2、仪器条件
（1）液相色谱条件：
色谱柱：ZORBAXEclipsePlusC183.0*100mm，1.8μm;
流速：0.4mL/min;进样量：10.0μL;柱温：40℃;
液相色谱梯度洗脱程序见表2-1。
（2）质谱条件
电离方式：电喷雾离子源，负离子模式ESI-;MRM
毛细管电压：3.0kV;喷嘴电压：0.5kV;离子源温度：100℃;脱溶剂气及鞘气：N2;脱溶剂气温度：350℃;脱溶剂气流量：360L/h;脱溶剂气压力：40psi;碰撞气：高纯N2;
保留时间、监测离子对、去簇电压及碰撞能量见表2-2。
3、计算公式
试样中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量按下式进行计算
二、不确定度的来源分析及测量数学模型的建立
从测量过程和数学模型分析，样品测定的不确定度来源有：标准溶液配制引入的不确定度urel（C）;标准曲线校准引入的不确定度urel（X0）;样品称量引入的不确定度urel（m）;样品溶液添加、稀释和定容引入的不确定度urel（V）;结果重复性引入的不确定度urel（frep）。
不确定度数学模型：
三、不确定度评定
1、标准溶液配制引入的不确定度
标准溶液配制包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液的配制和13C15-脱氧雪腐镰刀菌烯醇内标溶液的配制，因此标准溶液的相对标准不确定度为：
（1）标准溶液引入的不确定度
脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓度为200.3±6.2μg/mL、13C15-脱氧雪腐镰刀菌烯醇内标溶液浓度为25.0±0.2μg/mL，按正态分布置信概率P=95%，包含因子k=2，
（2）外标溶液配制、稀释引入的不确定度
标准品配制所使用的10mLA级容量瓶20℃时的容量允差为±0.020mL，服从三角分布，区间半宽度a（V10）=0.020ml*k=，由此引起的标准不确定度u1（V10）=a（V10）/k=0.020/=0.00817，实验室温度在（20±5）℃之间变动，甲醇的膨胀系数（20℃）为0.000118/℃，对10ml容量瓶由温度效应产生的体積变化为10*5*0.000118=0.059ml，服从均匀分布，k=，由此引起的不确定度u2（V10）=a/k=0.59/=0.0341mL，故u（V10）==0.0351，其相对标准不确定度urel（V1）=u（V10）/V10=0.00351。
标准溶液稀释引入的不确定度：标准溶液稀释使用200μl移液枪，其容量允差为±2.0μl，服从均匀分布，k=，由此引起的不确定度u1（V200）=a1（V200）/k=2.0/=1.15μL;由温度效应产生的体积变化分别为200*5*0.00115=1.18μl，服从均匀分布，k=，u2（V200）=1.18/=0.682μl，故稀释过程中移液枪使用引入的标准不确定度为u（V200）==1.34μL，稀释过程中用到10mLl容量瓶1次，移液枪50μL（DON）一次，故标准溶液稀释过程引入的相对标准不确定度为：
由此，标准溶液配制、稀释过程引入的相对标准不确定度为： 综上所述，外标溶液引入的相对标准不确定度为：
相关结果见表3-1。
（3）内标物引入的不确定度
内标物浓度引入的不确定度：内标溶液配制、稀释、添加引入的不确定度计算与外标的计算方法相同，其值为urel（V1）=u（V10）/V10=0.00351;实验过程中内标溶液的添加是用200μL移液枪（2次），故内标溶液稀释引入的不确定为urel（V2）==0.010，实验过程中，内标溶液的添加使用200μl移液枪，移液枪引入的标准不确定度为urel（V200）=1.35μL，样品前处理过程中内标溶液移取体积为20μL，故内标溶液添加引入的相对标准不确定度为urel（V3）=1.35/20=0.0675。由此内标配制、稀释、添加过程引入的相对标准不确定度为urel（V）===0.0683，故13C15-脱氧雪腐镰刀菌烯醇内标溶液引入的相对标准不确定度为urel（Cistd）==0.0684。
2、最小二乘法拟合引入的不确定度
试验中，配制6个浓度的校准溶液：1.0ng/mL，2.0ng/mL，5.0ng/mL，10.0ng/mL，20.0ng/mL，50.0ng/mL（其中含内标物13C15-脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓度均为10.0ng/mL），外标与内标的质量浓度比X0分别为0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00的6个标准溶液测定一次，得到内外标峰面积比值y，对以上测定数据采用最小二乘法进行拟合，得到校准曲线方程y=ax+b和拟合系数r2，相关结果见表3-2。
为了评定最小二乘法估计量的不确定度，首先必须对直接测量所得的测量数据进行不确定度评估，实际上就是求出测量数据的实验标准差：
公式中为当输入量为xj时，仪器响应值与拟合直线上对应的相应值之差。
在用间接式测量仪器测量时，利用校准曲线，在测量样品响应值y0后，可以按照线性回归方程计算被测量的预估值x0，其标准不确定度u（x0）为：
公式中s（y）为校准溶液峰面积比残差的标准偏差，b为拟合直线的斜率，p为样品平行测量的次数（p=6），n为拟合直线的数据总数（n=6），x0为样品平行测量p次结果的平均值，为绘制拟合直线全部输入值xi的总平局值，urel（x0）=u（x0）/x0，计算结果见表3-5。
3、样品称样量引入的不确定度
样品称样量使用万分之一天平准确称取，天平最大允许误差为±0.1mg，按均匀分布考虑，包含因子k=，不确定度为urel（m）=0.0001/=0.000003。
样品溶液添加、稀释和样品定容引入的不确定度：
样品溶液添加引入：实验过程中提取液的添加使用10ml移液器，根据JJG646-2006的规定，容量允差为±0.6%，服从均匀分布，k=，u1（V10）=10000a（V10）/k=0.00346ml，由温度效应产生的体积变化为10*5*0.00137=0.0685ml，服从均匀分布u2（V10）=0.0395ml，即urel（V1）=/10=0.00397。
样品溶液稀释引入的不确定度：实验过程中，氮吹浓缩5ml样品溶液使用10ml移液器，容量允差为±0.6%，服从均匀分布，k=，u1（V10）=5000a（V10）/k=0.00173ml，由温度效应产生的体积变化为5*5*0.00137=0.0342ml，服从均匀分布u2（V10）=0.0197ml，即urel（V2）=/5=0.00685。
定容体积引入的不确定度：样品定容使用1ml移液器，容量允许差为±1.0%，服从均匀分布，u1（V1000）=1000*1.0%/=5.774μl，实验室温度引起的体积变化可以忽略不计，故urel（V3）=5.774/1000=0.00577。
综上所述，样品溶液添加、稀释和定容引入的不确定度为urel（V）==0.00980。
结果重复性引入的不确定度：在重复性条件下对4ng进行了6次独立测试，平行测试结果和平均值见表3-6，根据贝塞尔公式计算的单次测量的标准不确定度：u（X）=s（X）=（3-8）
以多次测量结果的算术平均值为最佳估算值，则测定结果的标准不确定度为：u（）=s（）/（3-9）
由此结果重复性引入的相对标准不确定度：
结果见下表。
4、样品合成标准不确定度
样品中目标化合物的相对标准不确定度为：
合成标准不确定度u（x）=x*urel，取包含因子k=2，置信概率p=95%，则扩展不确定度为U（x）=k*u（x）。
四 结论
本文采用液相色谱串联质谱法对大米中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇进行测定，比较各分量不确定度的大小发现实验过程中标准溶液的配制带来的不确定度影响最大。该方法准确可靠，整个实验过程中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的不确定度分别为0.31μg/kg，为检测过程中脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测结果的准确性提高提供技术指导。
参考文献
[1]刘静，何立英，刘亚敏.脱氧雪腐镰刀菌烯醇的细胞毒性作用研究进展[J].武警医学院学报，2008，17（1）：68-70.
[2]金秀娟，朱旭东.脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其检测[J].粮油仓储科技通讯，2010，26（1）：47-49.
[3]王丽娟，柯润辉，安红梅，等.固相萃取柱净化-液相色谱-串联质谱法测定糕点中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物和玉米赤霉烯酮[J].食品工业科技，2017，38（14）：31-34，50.
[4]高家敏，曹進，丁宏.超高效液相色谱-串联质谱法测定化妆品中地塞米松含量的不确定度分析[J].中国药师，2018，21（3）：539-542，546.
[5]GB/T27418-2017测量不确定度评定和表示[S].中国标准出版社，2017.
[6]谢焕山，卢浩扬，陈雨晴，等.高效液相色谱-串联质谱法测定人血清中文拉法辛和O-去甲基文拉法辛的不确定度评价[J].中国医院药学杂志，2019，39（14）：1454-1459.
[7]吾建祥，杨德毅，刘莉，等.高效液相色谱-串联质谱法测定茭白中甲氨基阿维菌素苯甲酸盐残留量的不确定度评价[J].食品安全质量检测学报，2018，9（9）：2106-2112.
[8]晁伟杰.高效液相色谱-串联质谱法测定鲫鱼中孔雀石绿的不确定度评定[J].食品安全质量检测学报，2019，10（15）：5190-5195.
[9]CNAS-GL006化学分析中不确定度的评估指南[S].中国合格评定国家认可委员会，2019.
谱尼测试集团股份有限公司 北京市海淀区 100194