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【摘要】 目的：探讨黄酮类化合物柚皮苷对动脉粥样硬化（atherosclerosis， AS）大鼠主动脉过氧化物酶体增殖物激活受体-δ（peroxisome proliferator-activated receptors δ， PPAR-δ）、内皮细胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecular-1，VCAM-1）表达水平的影响。方法：通过喂养高脂饲料造成动脉粥样硬化的大鼠模型。实验动物分为正常对照组，AS模型组和柚皮苷AS组。实验结束后测定血中甘油三脂、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白及极低密度脂蛋白的水平，应用RT-PCR法检测大鼠主动脉PPAR-δ、VCAM-1的基因表达。结果：柚皮苷AS组血中甘油三脂、总胆固醇、低密度脂蛋白及极低密度脂蛋白的水平比AS模型组明显降低，高密度脂蛋白水平明显升高（P<0.01）；柚皮苷AS组主动脉PPAR-δ的基因表达高于模型组，而VCAM-1的基因表达则低于模型组 （P<0.05）；结论：柚皮苷可降低AS大鼠的血脂水平，上调主动脉PPAR-δ的基因表达，下调VCAM-1的基因表达，可能为其抗AS的机制之一。
【关键词】 柚皮苷； 动脉粥样硬化； 过氧化物酶体增殖物激活受体-δ； 内皮细胞黏附分子-1
AS是目前心血管疾病主要的死亡原因，发病机制主要为损伤-反应学说。在长期高脂血症情况下，增高的脂蛋白对动脉内膜产生功能性的损伤，使得单核细胞黏附、迁移、吞噬，最终形成脂质条纹[1]。因此脂蛋白的代谢、细胞的黏附是其中两个重要的环节。
PPAR-δ作为过氧化物酶增殖体激活受体（PPAR），是一类基因转录因子，属于核激素受体超家族[2]。现阶段认为，PPAR-δ在脂肪代谢，改善胰岛素抵抗和抗血管炎症反应中起着重要作用[3]。
VCAM-1 是免疫球蛋白超基因家族，主要由血管内皮细胞表达，在高血脂刺激AS 形成过程中，能促进免疫细胞浸润，使单核细胞和淋巴细胞粘附于血管内皮[4]。
柚皮苷是一种双氢黄酮类化合物，在某些传统中药及水果中含量丰富，如枳实，骨碎补，柚、橘类果皮及汁等中。研究发现，柚皮苷具有非常广泛的药理作用，主要表现为抗炎、抗氧化及抗动脉粥样硬化[5-6]。
本实验拟在观察柚皮苷对AS大鼠主动脉PPAR-δ、VCAM-1基因表达的影响。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂 柚皮苷由陕西慧科植物开发有限公司提供、胆酸淮北市创凯生化原料厂提供、胆固醇成都科龙化工试剂厂提供、丙基硫氧嘧啶苏州恒益医药原料有限公司提供、猪油来自市售板油炼制、羧甲基纤维素（CMC）上海化学试剂采购供应站提供、Trizol溶液、逆转录试剂盒及荧光定量PCR检测试剂盒由大连宝生物有限公司提供、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇测定试剂盒由浙江东瓯生物工程有限公司提供。
1.2 检测仪器 日立7170S全自动生化分析仪，ABI PRISM 7000热循环仪。
1.3 动物 SPF SD雄性大鼠共40只，体重（220±20）g [四川省医学科学院四川省人民医院实验动物研究所提供，合格证号（SCXK川2006-14）]。实验由川北医学院药物研究所SPF级动物实验室完成。
1.4 方法
1.4.1 动物分组给药 动脉粥样硬化饲料配方，脂肪乳剂：猪油20%，胆固醇10%，胆酸钠2%，丙基硫氧嘧啶1%，吐温-80 20%，丙二醇30%加水至100%。动物分为3组，一组给普通饲料，另两组给予AS饲料，共12周，后改喂普通饲料。然后分别灌胃给药，普通饲料组及AS对照组（为0.5%CMC溶剂对照）、柚皮苷AS组（柚皮苷10 mg/100 g），给药容量为1 ml/100 g体重，每天1次，连续8周，药物均以0.5%CMC配制。
1.4.2 主动脉留取 实验结束后乙醚麻醉动物，剖开胸腹腔，腹主动脉取血，离心（3500 rpm）5 min取血清备用。取全主动脉，剥离外膜脂肪组织，用于提取RNA。
1.4.3 逆转录PCR 将大鼠主动脉标本研磨匀浆后，移入EP管，采用氯仿-酚法抽提RNA。随后RNA变性，逆转录合成cDNA。
1.4.4 荧光定量PCR检测 引物由英俊公司合成。PPAR-δ引物序列，上游引物：5’-GTT CGC CAA GGT GCT CCA G-3’；下游引物：5’-GCT CAT ATC TGT CTC CGT CTT CTT-3’。VCAM-1引物序列，上游引物：5’-GGA GACACT GTA ATT ATC TCC TG-3’；下游引物：5’-TCC TTT CAT GTT GGC TTT TCT TGC-3’。 GAPDH引物序列，上游引物：5’-CTC CCA TTC CTC CAC CTT G-3’。下游引物：5’-CCA CCA CCC TGT TGC TGT AG-3’。取1 μl cDNA为模板，上游引物和下游引物各0.2 μl，反应体系为10 μl。采用两步法进行RT-PCR扩增，并进行荧光检测。目的基因表达量的相对水平，△△CT =△CT （test）-△CT （calibrator），其中△CT （test）= CT （target， test）- CT （ref， test）；△CT （calibrator）=CT （target， calibrator）-CT （ref， calibrator）。
1.4.5 血清脂质指标测定 采用全自动生化仪测定血清甘油三脂（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein cholesterol，HDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein-cholesterol，LDL）及极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein-cholesterol，VLDL）的水平。 1.5 统计学处理 应用SPSS 11.5软件包进行统计分析。组间显著性检验采用ANOVA，两组之间的显著性检验结果采用 independent t-test，方差齐性检验采用Levene’s Test。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 血脂结果 AS对照组与常规饲料组比较，血脂指标均显著升高（表1）。
2.2 柚皮苷对血脂的影响 血脂水平比较：与AS对照组相比，柚皮苷AS组TG、TC、VLDL水平明显降低，HDL水平明显增高（P<0.01）（表2）。
2.3 荧光定量结果 荧光RT-PCR检测结果表明，与AS对照组比较，柚皮苷AS组主动脉PPAR-δ mRNA表达增高，VCAM-1 mRNA 表达降低（P<0.05）（表3）。
3 讨论
本实验发现，与AS对照组相比，给予柚皮苷的AS组大鼠血中TC、TG、VLDL水平明显降低，HDL水平增高。柚皮苷具有广泛的生物活性。在脂代谢方面，在给予柚皮苷6个星期后，动物可表现为肝脏胆固醇合成降低，HDL-C/TC比例升高，HDL-C无变化，动脉硬化指数降低[7]。研究证实，柚皮苷能降低2型糖尿病小鼠肝脏中脂肪酸合酶和葡糖糖-6-磷酸脱氢酶的水平[8]。这些可能与下调脂酰辅酶A胆固醇酰基转移酶的活性，增加粪便甾醇类物质排出等有关[7]。
实验中进一步检测了实验大鼠主动脉PPAR-δ、VCAM-1 mRNA的表达。发现与AS对照组相比，给药组大鼠主动脉PPAR-δ的基因表达增加，而VCAM-1的基因表达下降。在离体细胞实验中报道柚皮苷可能通过PPAR-γ抑制脂肪细胞分化相关基因的表达，从而抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化[9]。动物实验中发现给予柚皮苷或柚皮素后，2型糖尿病小鼠的脂肪细胞、肝脏和肾脏组织中PPAR-γ的表达上调[8，10]。给予选择性PPAR-δ激动剂GW501516以后，罹患代谢综合征的印度恒河猴血中TC、HDL的浓度增加，TG和胰岛素的水平降低[11]。
柚皮苷对VCAM-1的作用报道不一。在Lee CH等对高脂模型家兔的实验中发现，柚皮苷可降低胸主动脉VCAM-1和单核细胞化学趋化蛋白-1的表达[12]。Jeong等[13]研究发现，毛地黄黄酮等黄酮类物质可抑制ox-LDL活化的人脐静脉内皮细胞表达VCAM-1和E-选择素。而Kim S W等在人脐静脉内皮细胞中发现，事先给予柚皮苷刺激后细胞间黏附分子水平增加，但VCAM-1和E-选择素无明显变化[14]。本实验结果与前两者一致。
综上所述，实验中发现柚皮苷可降低AS大鼠的血脂水平，上调主动脉PPAR-δ的基因表达，下调VCAM-1的基因表达，可能通过影响脂蛋白代谢和细胞黏附达到抗AS的作用。
参考文献
[1] Jellinger P S， Smith D A， Mehta A E， et al. American association of clinical endocrinologists’ guidelines for management of dyslipidemia and prevention of atherosclerosis： Executive summary[J]. Endocr Pract， 2012，18：269-293.
[2] Filip-Ciubotaru F， Manciuc C， Grigore C， et al. [ppars： Physiological functions and pharmacological roles of agonists in human diseases. Note ii][J]. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi，2012，116：240-247.
[3] Ooi E M， Watts G F， Sprecher DL， et al. Mechanism of action of a peroxisome proliferator-activated receptor （ppar）-delta agonist on lipoprotein metabolism in dyslipidemic subjects with central obesity[J]. J Clin Endocrinol Metab，2011，96：E1568-1576.
[4] Mestas J， Ley K. Monocyte-endothelial cell interactions in the development of atherosclerosis[J]. Trends Cardiovasc Med， 2008，18：228-232.
[5] Pu P， Gao D M， Mohamed S， et al. Naringin ameliorates metabolic syndrome by activating amp-activated protein kinase in mice fed a high-fat diet[J]. Arch Biochem Biophys， 2012，518：61-70.
[6] Bodas R， Prieto N， Jordan M J， et al. The liver antioxidant status of fattening lambs is improved by naringin dietary supplementation at 0.15% rates but not meat quality[J]. Animal，2012，6：863-870.
[7] Xulu S， Oroma Owira P M. Naringin ameliorates atherogenic dyslipidemia but not hyperglycemia in rats with type 1 diabetes[J]. J Cardiovasc Pharmacol， 2012，59：133-141. [8] Jung U J， Lee M K， Park Y B， et al. Effect of citrus flavonoids on lipid metabolism and glucose-regulating enzyme mrna levels in type-2 diabetic mice[J]. Int J Biochem Cell Biol，2006，38：1134-1145.
[9] Morikawa K， Nonaka M， Mochizuki H， et al. Naringenin and hesperetin induce growth arrest， apoptosis， and cytoplasmic fat deposit in human preadipocytes[J]. J Agric Food Chem，2008，56：11030-11037.
[10] Sharma A K， Bharti S， Ojha S， et al. Up-regulation of ppargamma， heat shock protein-27 and -72 by naringin attenuates insulin resistance， beta-cell dysfunction， hepatic steatosis and kidney damage in a rat model of type 2 diabetes[J]. Br J Nutr，2011，106：1713-1723.
[11] Oliver W R， Jr.， Shenk J L， Snaith MR， et al. A selective peroxisome proliferator-activated receptor delta agonist promotes reverse cholesterol transport[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2001，98：5306-5311.
[12] Jeon S M， Park Y B， Choi M S. Antihypercholesterolemic property of naringin alters plasma and tissue lipids， cholesterol-regulating enzymes， fecal sterol and tissue morphology in rabbits[J]. Clin Nutr， 2004，23：1025-1034.
[13] Jeong Y J， Choi Y J， Choi J S， et al. Attenuation of monocyte adhesion and oxidised ldl uptake in luteolin-treated human endothelial cells exposed to oxidised ldl[J]. Br J Nutr，2007，97：447-457.
[14] Kim S W， Kim C E， Kim M H. Flavonoids inhibit high glucose-induced up-regulation of icam-1 via the p38 mapk pathway in human vein endothelial cells[J]. Biochem Biophys Res Commun，2011，415：602-607.
（收稿日期：2012-11-06） （本文编辑：车艳）
【关键词】 柚皮苷； 动脉粥样硬化； 过氧化物酶体增殖物激活受体-δ； 内皮细胞黏附分子-1
AS是目前心血管疾病主要的死亡原因，发病机制主要为损伤-反应学说。在长期高脂血症情况下，增高的脂蛋白对动脉内膜产生功能性的损伤，使得单核细胞黏附、迁移、吞噬，最终形成脂质条纹[1]。因此脂蛋白的代谢、细胞的黏附是其中两个重要的环节。
PPAR-δ作为过氧化物酶增殖体激活受体（PPAR），是一类基因转录因子，属于核激素受体超家族[2]。现阶段认为，PPAR-δ在脂肪代谢，改善胰岛素抵抗和抗血管炎症反应中起着重要作用[3]。
VCAM-1 是免疫球蛋白超基因家族，主要由血管内皮细胞表达，在高血脂刺激AS 形成过程中，能促进免疫细胞浸润，使单核细胞和淋巴细胞粘附于血管内皮[4]。
柚皮苷是一种双氢黄酮类化合物，在某些传统中药及水果中含量丰富，如枳实，骨碎补，柚、橘类果皮及汁等中。研究发现，柚皮苷具有非常广泛的药理作用，主要表现为抗炎、抗氧化及抗动脉粥样硬化[5-6]。
本实验拟在观察柚皮苷对AS大鼠主动脉PPAR-δ、VCAM-1基因表达的影响。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂 柚皮苷由陕西慧科植物开发有限公司提供、胆酸淮北市创凯生化原料厂提供、胆固醇成都科龙化工试剂厂提供、丙基硫氧嘧啶苏州恒益医药原料有限公司提供、猪油来自市售板油炼制、羧甲基纤维素（CMC）上海化学试剂采购供应站提供、Trizol溶液、逆转录试剂盒及荧光定量PCR检测试剂盒由大连宝生物有限公司提供、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇测定试剂盒由浙江东瓯生物工程有限公司提供。
1.2 检测仪器 日立7170S全自动生化分析仪，ABI PRISM 7000热循环仪。
1.3 动物 SPF SD雄性大鼠共40只，体重（220±20）g [四川省医学科学院四川省人民医院实验动物研究所提供，合格证号（SCXK川2006-14）]。实验由川北医学院药物研究所SPF级动物实验室完成。
1.4 方法
1.4.1 动物分组给药 动脉粥样硬化饲料配方，脂肪乳剂：猪油20%，胆固醇10%，胆酸钠2%，丙基硫氧嘧啶1%，吐温-80 20%，丙二醇30%加水至100%。动物分为3组，一组给普通饲料，另两组给予AS饲料，共12周，后改喂普通饲料。然后分别灌胃给药，普通饲料组及AS对照组（为0.5%CMC溶剂对照）、柚皮苷AS组（柚皮苷10 mg/100 g），给药容量为1 ml/100 g体重，每天1次，连续8周，药物均以0.5%CMC配制。
1.4.2 主动脉留取 实验结束后乙醚麻醉动物，剖开胸腹腔，腹主动脉取血，离心（3500 rpm）5 min取血清备用。取全主动脉，剥离外膜脂肪组织，用于提取RNA。
1.4.3 逆转录PCR 将大鼠主动脉标本研磨匀浆后，移入EP管，采用氯仿-酚法抽提RNA。随后RNA变性，逆转录合成cDNA。
1.4.4 荧光定量PCR检测 引物由英俊公司合成。PPAR-δ引物序列，上游引物：5’-GTT CGC CAA GGT GCT CCA G-3’；下游引物：5’-GCT CAT ATC TGT CTC CGT CTT CTT-3’。VCAM-1引物序列，上游引物：5’-GGA GACACT GTA ATT ATC TCC TG-3’；下游引物：5’-TCC TTT CAT GTT GGC TTT TCT TGC-3’。 GAPDH引物序列，上游引物：5’-CTC CCA TTC CTC CAC CTT G-3’。下游引物：5’-CCA CCA CCC TGT TGC TGT AG-3’。取1 μl cDNA为模板，上游引物和下游引物各0.2 μl，反应体系为10 μl。采用两步法进行RT-PCR扩增，并进行荧光检测。目的基因表达量的相对水平，△△CT =△CT （test）-△CT （calibrator），其中△CT （test）= CT （target， test）- CT （ref， test）；△CT （calibrator）=CT （target， calibrator）-CT （ref， calibrator）。
1.4.5 血清脂质指标测定 采用全自动生化仪测定血清甘油三脂（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein cholesterol，HDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein-cholesterol，LDL）及极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein-cholesterol，VLDL）的水平。 1.5 统计学处理 应用SPSS 11.5软件包进行统计分析。组间显著性检验采用ANOVA，两组之间的显著性检验结果采用 independent t-test，方差齐性检验采用Levene’s Test。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 血脂结果 AS对照组与常规饲料组比较，血脂指标均显著升高（表1）。
2.2 柚皮苷对血脂的影响 血脂水平比较：与AS对照组相比，柚皮苷AS组TG、TC、VLDL水平明显降低，HDL水平明显增高（P<0.01）（表2）。
2.3 荧光定量结果 荧光RT-PCR检测结果表明，与AS对照组比较，柚皮苷AS组主动脉PPAR-δ mRNA表达增高，VCAM-1 mRNA 表达降低（P<0.05）（表3）。
3 讨论
本实验发现，与AS对照组相比，给予柚皮苷的AS组大鼠血中TC、TG、VLDL水平明显降低，HDL水平增高。柚皮苷具有广泛的生物活性。在脂代谢方面，在给予柚皮苷6个星期后，动物可表现为肝脏胆固醇合成降低，HDL-C/TC比例升高，HDL-C无变化，动脉硬化指数降低[7]。研究证实，柚皮苷能降低2型糖尿病小鼠肝脏中脂肪酸合酶和葡糖糖-6-磷酸脱氢酶的水平[8]。这些可能与下调脂酰辅酶A胆固醇酰基转移酶的活性，增加粪便甾醇类物质排出等有关[7]。
实验中进一步检测了实验大鼠主动脉PPAR-δ、VCAM-1 mRNA的表达。发现与AS对照组相比，给药组大鼠主动脉PPAR-δ的基因表达增加，而VCAM-1的基因表达下降。在离体细胞实验中报道柚皮苷可能通过PPAR-γ抑制脂肪细胞分化相关基因的表达，从而抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化[9]。动物实验中发现给予柚皮苷或柚皮素后，2型糖尿病小鼠的脂肪细胞、肝脏和肾脏组织中PPAR-γ的表达上调[8，10]。给予选择性PPAR-δ激动剂GW501516以后，罹患代谢综合征的印度恒河猴血中TC、HDL的浓度增加，TG和胰岛素的水平降低[11]。
柚皮苷对VCAM-1的作用报道不一。在Lee CH等对高脂模型家兔的实验中发现，柚皮苷可降低胸主动脉VCAM-1和单核细胞化学趋化蛋白-1的表达[12]。Jeong等[13]研究发现，毛地黄黄酮等黄酮类物质可抑制ox-LDL活化的人脐静脉内皮细胞表达VCAM-1和E-选择素。而Kim S W等在人脐静脉内皮细胞中发现，事先给予柚皮苷刺激后细胞间黏附分子水平增加，但VCAM-1和E-选择素无明显变化[14]。本实验结果与前两者一致。
综上所述，实验中发现柚皮苷可降低AS大鼠的血脂水平，上调主动脉PPAR-δ的基因表达，下调VCAM-1的基因表达，可能通过影响脂蛋白代谢和细胞黏附达到抗AS的作用。
参考文献
[1] Jellinger P S， Smith D A， Mehta A E， et al. American association of clinical endocrinologists’ guidelines for management of dyslipidemia and prevention of atherosclerosis： Executive summary[J]. Endocr Pract， 2012，18：269-293.
[2] Filip-Ciubotaru F， Manciuc C， Grigore C， et al. [ppars： Physiological functions and pharmacological roles of agonists in human diseases. Note ii][J]. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi，2012，116：240-247.
[3] Ooi E M， Watts G F， Sprecher DL， et al. Mechanism of action of a peroxisome proliferator-activated receptor （ppar）-delta agonist on lipoprotein metabolism in dyslipidemic subjects with central obesity[J]. J Clin Endocrinol Metab，2011，96：E1568-1576.
[4] Mestas J， Ley K. Monocyte-endothelial cell interactions in the development of atherosclerosis[J]. Trends Cardiovasc Med， 2008，18：228-232.
[5] Pu P， Gao D M， Mohamed S， et al. Naringin ameliorates metabolic syndrome by activating amp-activated protein kinase in mice fed a high-fat diet[J]. Arch Biochem Biophys， 2012，518：61-70.
[6] Bodas R， Prieto N， Jordan M J， et al. The liver antioxidant status of fattening lambs is improved by naringin dietary supplementation at 0.15% rates but not meat quality[J]. Animal，2012，6：863-870.
[7] Xulu S， Oroma Owira P M. Naringin ameliorates atherogenic dyslipidemia but not hyperglycemia in rats with type 1 diabetes[J]. J Cardiovasc Pharmacol， 2012，59：133-141. [8] Jung U J， Lee M K， Park Y B， et al. Effect of citrus flavonoids on lipid metabolism and glucose-regulating enzyme mrna levels in type-2 diabetic mice[J]. Int J Biochem Cell Biol，2006，38：1134-1145.
[9] Morikawa K， Nonaka M， Mochizuki H， et al. Naringenin and hesperetin induce growth arrest， apoptosis， and cytoplasmic fat deposit in human preadipocytes[J]. J Agric Food Chem，2008，56：11030-11037.
[10] Sharma A K， Bharti S， Ojha S， et al. Up-regulation of ppargamma， heat shock protein-27 and -72 by naringin attenuates insulin resistance， beta-cell dysfunction， hepatic steatosis and kidney damage in a rat model of type 2 diabetes[J]. Br J Nutr，2011，106：1713-1723.
[11] Oliver W R， Jr.， Shenk J L， Snaith MR， et al. A selective peroxisome proliferator-activated receptor delta agonist promotes reverse cholesterol transport[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2001，98：5306-5311.
[12] Jeon S M， Park Y B， Choi M S. Antihypercholesterolemic property of naringin alters plasma and tissue lipids， cholesterol-regulating enzymes， fecal sterol and tissue morphology in rabbits[J]. Clin Nutr， 2004，23：1025-1034.
[13] Jeong Y J， Choi Y J， Choi J S， et al. Attenuation of monocyte adhesion and oxidised ldl uptake in luteolin-treated human endothelial cells exposed to oxidised ldl[J]. Br J Nutr，2007，97：447-457.
[14] Kim S W， Kim C E， Kim M H. Flavonoids inhibit high glucose-induced up-regulation of icam-1 via the p38 mapk pathway in human vein endothelial cells[J]. Biochem Biophys Res Commun，2011，415：602-607.
（收稿日期：2012-11-06） （本文编辑：车艳）