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摘要[目的]建立roGFP1探针响应玉米体内氧化还原状态变化的稳定表达系统。[方法]首先利用基因枪介导玉米幼胚转化法瞬时表达roGFP1基因，利用激光共聚焦显微镜405和488 nm激发光通道对10 mmol/L H2O2和2 mmol/L DTT溶液处理下的幼胚进行510 nm的GFP荧光成像，后通过ImageJ处理图像和分析荧光比值[405/488 nm]；同时利用农杆菌介导玉米幼胚转化法开展roGFP1基因的玉米稳定转化，进行Southern Blot鉴定和荧光显微镜观察。[结果]在玉米幼胚瞬时表达系统中，经10 mmol/L H2O2处理后，roGFP1探针的荧光强度比值[405/488 nm]由原来的0.844升高至1.837，而在2 mmol/L DTT溶液处理下的荧光强度比值下降至0.911；经Southern Blot鉴定和GFP荧光检测获得了roGFP1转基因阳性植株。[结论]在玉米幼胚瞬时表达系统中，roGFP1探针能够响应由外源氧化还原剂引起的体内氧化还原状态改变；获得了表达roGFP1的转基因玉米植株。
关键词roGFP1；荧光强度比值；玉米；瞬时表达；稳定转化
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）12-03491-03
作者简介吴佳梅（1990- ），女，江苏常州人，硕士研究生，研究方向：植物抗逆分子生物学。
玉米是我国重要的粮食作物和饲料来源，自然条件下，干旱、低温、高盐等非生物逆境制约了玉米的生长发育和产量。活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）在植物遭受非生物逆境时大量积累[1]，曾一度被认为是有氧代谢过程中具有毒性的副产物。然而近年来的研究发现，活性氧作为不可或缺的成分参与调控植物的生长发育以及各种胁迫反应，是细胞信号转导网络过程中一种重要的信号分子[1]。ROS的作用机制成为当今的研究热点，利用植物的ROS信号转导网络在提高拟南芥、紫花苜蓿、小麦和水稻等的抗逆性研究上取得了较大进展[2，13-14]，而测定植物体内ROS含量的动态变化对于研究植物ROS信号转导网络具有重要意义。以往通常使用单态氧（Singlet Oxygen Sensor Green，SOSG）探针，超氧化物阴离子（Dihydroethidium，DHE）探针，二氢罗丹明（Dihydrorhodamine 123，DHR）染料，Amplex Red试剂，OxyBurst green试剂和Dihydrodichlorofluorescein（H2DCF）等荧光探针来测定植物体内ROS含量[3]，但是这些方法都存在着诸多不足。一方面，由于不可逆性，无法得知植物体内ROS含量的动态变化；另一方面，探针自身也存在潜在的问题，比如当OxyBurst green接触到氧气时就会被氧化[4]。Hanson[5]等对野生型绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）进行改造后得到氧化还原敏感的roGFP1 biosensor （C48S，S147C和Q204C），在氧化环境下，roGFP1的147位和204位的半胱氨酸残基形成二硫键[6]，由于生色团的中性电子和阴离子之间的内在平衡，roGFP1探针在400 nm和475～490 nm的激发光下的荧光强度比值发生改变，这种荧光强度比值法仅受激发光的影响，从而消除了由探针浓度、光漂白以及组织厚度等引起的误差[5]。roGFP探针在哺乳动物细胞中能够响应氧化还原状态改变[5，7]得到证实后，被广泛应用于拟南芥[8-9]、烟草叶肉细胞[10]、酵母[11]和小鼠表皮细胞[12]中。
前人对roGFP探针的研究主要集中在哺乳动物细胞和拟南芥等模式植物细胞中，在作物细胞中的研究鲜有报道。探究roGFP 探针能否响应玉米体内的氧还改变对于进一步研究玉米ROS信号转导网络、提高玉米抗逆性具有重要意义。笔者利用玉米幼胚瞬时表达系统检测roGFP1探针的荧光强度比值[405/488 nm]是否响应动态的氧化还原环境，然后利用农杆菌介导玉米幼胚转化法创制转基因阳性植株，旨在为规模化鉴定ROS信号转导基因提供直观便捷的检测工具。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1研究对象。杂交种Hi II和自交系综31玉米幼胚。
1.1.2供试菌株以及载体。大肠杆菌DH5α和农杆菌C58C1由实验室保存；含有9zf（-）PubiTnos载体的DH5α大肠杆菌菌株由实验室保存；pCAMBIA1304P35SroGFP1 Tnos载体，由Keni Jiang惠赠。
1.1.3主要仪器。PTC0200型PCR仪和PDS1000/He台式基因枪，购自BioRad公司；LSM 700激光共聚焦显微镜和HAL 100荧光显微镜，购自ZEISS公司。
1.1.4主要试剂。限制性内切酶，购自New England Biolabs（NEB）公司；Taq DNA聚合酶和dNTP等试剂，均购自宝生物工程（大连）有限公司；引物合成及测序，由生工生物工程（上海）有限公司完成；纤维素酶和离析酶，均购自日本Yakult Pharmaceutical公司；甘露醇、PEG以及一些常用试剂，均购自Amresco公司。
1.2方法
1.2.1roGFP1基因表达载体的构建。按照图1的方法构建roGFP1基因表达载体9zf（-）PubiroGFP1Tnos和pCAMBIA1304PubiroGFP1Tnos；用NcoI和Afl II双酶切pCAMBIA1304P35sroGFP1Tnos质粒获得roGFP1片段，同时用EcoR V酶切9zf（-）PubiTnos获得大片段，roGFP1roGFP1片段经Klenow聚合酶补平后和9zf（-）PubiTnos回收片段经酶连后获得9zf（-）PubiroGFP1Tnos载体，转化大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定和测序，于-80 ℃保存阳性克隆。9zf（-）PubiroGFP1Tnos质粒经Bam HI和Afl II酶切后获得ubiroGFP1片段，用Bam HI和Afl II酶切pCAMBIA1304P35s roGFP1Tnos后獲得大片段，将ubiroGFP1和pCAMBIA1304P35sroGFP1Tnos回收片段酶连后获得pCAMBIA1304 PubiroGFP1Tnos，转化农杆菌C58C1，经酶切鉴定和测序后，于-80 ℃保存阳性克隆。 图1roGFP1基因的玉米表达载体构建流程1.2.2玉米幼胚瞬时表达系统的建立。以Hi II杂交系授粉后20 d的玉米幼穗为材料，经过5% NaClO处理后剥幼胚，将幼胚用MS清洗2次后转移至固体高渗培养基中；用10 μl金粉包裹1 μg质粒制成微弹；轰击幼胚过程按照基因枪说明书进行，气压为7.586 MPa，完成后放置植物培养箱内过夜培养。
1.2.3激光共聚焦显微镜观察。将基因枪转化后培养过的幼胚制成横切片置于载玻片上盖上盖玻片后利用ZEISS LSM700，选取405和488 nm 2个通道进行roGFP1观察和拍摄，随后加入10 mmol/L H2O2处理5～10 min并拍摄图像，完毕后吸去H2O2溶液，加入2 mmol/L DTT溶液处理5～10 min再次拍摄图像。
1.2.4农杆菌介导转化玉米幼胚。用pCAMBIA1304PubiroGFP1Tnos载体转化C58C1农杆菌获得转化菌株；用该转化菌株菌液浸染综31野生型玉米幼胚，经过共培养后，转入到含潮霉素B（Hygromycin B）的选择培养基上进行筛选，将诱导分化的玉米幼苗移栽至大棚继续培养。
1.2.5PCR 和Southern Blot鉴定转基因植株。PCR鉴定所用引物为FWhyg和RV35S（表1），条件为变性温度95 ℃，45 s，退火温度60 ℃，40 s，延伸温度72 ℃，1 min，30个循环，阳性植株PCR产物应出现大小为542 bp，然后荧光观察玉米叶片。结合两者的初步鉴定，将筛选出的玉米材料做Southern Blot鉴定，大致过程如下：利用roGFPF和roGFPR（表1）扩增出roGFP1基因特异的探针；用CTAB法大量提取玉米基因组DNA，Hind III 酶切40 V电泳过夜后将凝胶进行酸碱变性，利用毛细管碱性转移法转膜18 h，将膜80 ℃烤箱烘烤2 h后进行预雜交，2 h后用同位素标记的roGFP1探针进行杂交试验，18 h后洗膜和压片。
1.2.6统计分析。利用ImageJ软件对图片进行处理，荧光强度比值计算过程如前所述[8]。
2结果与分析
2.1RoGFP1探针响应H2O2和DTT引起的玉米幼胚氧化还原状态改变为了探究roGFP1探针是否响应玉米体内氧化还原状态的改变，试验利用基因枪介导转化法在玉米幼胚中瞬时表达roGFP1基因，通过激光共聚焦显微镜观察不同氧化还原处理下幼胚中的405和488 nm荧光强度并计算比值。结果发现，roGFP1基因能在玉米幼胚中成功表达；向幼胚切片中先后加入10 mmol/L H2O2溶液roGFP1探针迅速被氧化，荧光强度比值从0.844升高至1.837，而再加入2 mmol、L DTT溶液后roGFP1探针又被还原，荧光强度比值下降至0.911（图2）。这表明roGFP1基因能够在玉米幼胚中成功表达，并且对幼胚细胞内的可逆性氧化还原状态改变作出响应。
注：（A）为未处理的玉米幼胚；比值的颜色代表roGFP1的氧化还原状态，蓝色表示roGFP1的完全还原状态，黄色表示roGFP1的完全氧化状态；（B）为经10 mmol/LH2O2溶液处理的幼胚；（C）为经2 mmol/LDTT溶液处理的幼胚；Scale bar=300 pixel。
roGFP探针在众多植物细胞中的研究备受关注，然而在玉米中还缺乏研究。试验首先通过在Hi II植株授粉后20 d的玉米幼胚中瞬时表达roGFP1基因试验证实，roGFP1能够在玉米中响应H2O2和DTT引起的可逆性氧化还原状态改变，这与Meyer[8]利用roGFP2探针在拟南芥根中的研究结果相吻合。试验随后利用农杆菌浸染综31玉米幼胚，诱导分化的玉米幼苗经荧光显微镜观察和Southern Blot鉴定后存在阳性植株，表明roGFP1基因已经整合到玉米基因组中。
关键词roGFP1；荧光强度比值；玉米；瞬时表达；稳定转化
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）12-03491-03
作者简介吴佳梅（1990- ），女，江苏常州人，硕士研究生，研究方向：植物抗逆分子生物学。
玉米是我国重要的粮食作物和饲料来源，自然条件下，干旱、低温、高盐等非生物逆境制约了玉米的生长发育和产量。活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）在植物遭受非生物逆境时大量积累[1]，曾一度被认为是有氧代谢过程中具有毒性的副产物。然而近年来的研究发现，活性氧作为不可或缺的成分参与调控植物的生长发育以及各种胁迫反应，是细胞信号转导网络过程中一种重要的信号分子[1]。ROS的作用机制成为当今的研究热点，利用植物的ROS信号转导网络在提高拟南芥、紫花苜蓿、小麦和水稻等的抗逆性研究上取得了较大进展[2，13-14]，而测定植物体内ROS含量的动态变化对于研究植物ROS信号转导网络具有重要意义。以往通常使用单态氧（Singlet Oxygen Sensor Green，SOSG）探针，超氧化物阴离子（Dihydroethidium，DHE）探针，二氢罗丹明（Dihydrorhodamine 123，DHR）染料，Amplex Red试剂，OxyBurst green试剂和Dihydrodichlorofluorescein（H2DCF）等荧光探针来测定植物体内ROS含量[3]，但是这些方法都存在着诸多不足。一方面，由于不可逆性，无法得知植物体内ROS含量的动态变化；另一方面，探针自身也存在潜在的问题，比如当OxyBurst green接触到氧气时就会被氧化[4]。Hanson[5]等对野生型绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）进行改造后得到氧化还原敏感的roGFP1 biosensor （C48S，S147C和Q204C），在氧化环境下，roGFP1的147位和204位的半胱氨酸残基形成二硫键[6]，由于生色团的中性电子和阴离子之间的内在平衡，roGFP1探针在400 nm和475～490 nm的激发光下的荧光强度比值发生改变，这种荧光强度比值法仅受激发光的影响，从而消除了由探针浓度、光漂白以及组织厚度等引起的误差[5]。roGFP探针在哺乳动物细胞中能够响应氧化还原状态改变[5，7]得到证实后，被广泛应用于拟南芥[8-9]、烟草叶肉细胞[10]、酵母[11]和小鼠表皮细胞[12]中。
前人对roGFP探针的研究主要集中在哺乳动物细胞和拟南芥等模式植物细胞中，在作物细胞中的研究鲜有报道。探究roGFP 探针能否响应玉米体内的氧还改变对于进一步研究玉米ROS信号转导网络、提高玉米抗逆性具有重要意义。笔者利用玉米幼胚瞬时表达系统检测roGFP1探针的荧光强度比值[405/488 nm]是否响应动态的氧化还原环境，然后利用农杆菌介导玉米幼胚转化法创制转基因阳性植株，旨在为规模化鉴定ROS信号转导基因提供直观便捷的检测工具。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1研究对象。杂交种Hi II和自交系综31玉米幼胚。
1.1.2供试菌株以及载体。大肠杆菌DH5α和农杆菌C58C1由实验室保存；含有9zf（-）PubiTnos载体的DH5α大肠杆菌菌株由实验室保存；pCAMBIA1304P35SroGFP1 Tnos载体，由Keni Jiang惠赠。
1.1.3主要仪器。PTC0200型PCR仪和PDS1000/He台式基因枪，购自BioRad公司；LSM 700激光共聚焦显微镜和HAL 100荧光显微镜，购自ZEISS公司。
1.1.4主要试剂。限制性内切酶，购自New England Biolabs（NEB）公司；Taq DNA聚合酶和dNTP等试剂，均购自宝生物工程（大连）有限公司；引物合成及测序，由生工生物工程（上海）有限公司完成；纤维素酶和离析酶，均购自日本Yakult Pharmaceutical公司；甘露醇、PEG以及一些常用试剂，均购自Amresco公司。
1.2方法
1.2.1roGFP1基因表达载体的构建。按照图1的方法构建roGFP1基因表达载体9zf（-）PubiroGFP1Tnos和pCAMBIA1304PubiroGFP1Tnos；用NcoI和Afl II双酶切pCAMBIA1304P35sroGFP1Tnos质粒获得roGFP1片段，同时用EcoR V酶切9zf（-）PubiTnos获得大片段，roGFP1roGFP1片段经Klenow聚合酶补平后和9zf（-）PubiTnos回收片段经酶连后获得9zf（-）PubiroGFP1Tnos载体，转化大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定和测序，于-80 ℃保存阳性克隆。9zf（-）PubiroGFP1Tnos质粒经Bam HI和Afl II酶切后获得ubiroGFP1片段，用Bam HI和Afl II酶切pCAMBIA1304P35s roGFP1Tnos后獲得大片段，将ubiroGFP1和pCAMBIA1304P35sroGFP1Tnos回收片段酶连后获得pCAMBIA1304 PubiroGFP1Tnos，转化农杆菌C58C1，经酶切鉴定和测序后，于-80 ℃保存阳性克隆。 图1roGFP1基因的玉米表达载体构建流程1.2.2玉米幼胚瞬时表达系统的建立。以Hi II杂交系授粉后20 d的玉米幼穗为材料，经过5% NaClO处理后剥幼胚，将幼胚用MS清洗2次后转移至固体高渗培养基中；用10 μl金粉包裹1 μg质粒制成微弹；轰击幼胚过程按照基因枪说明书进行，气压为7.586 MPa，完成后放置植物培养箱内过夜培养。
1.2.3激光共聚焦显微镜观察。将基因枪转化后培养过的幼胚制成横切片置于载玻片上盖上盖玻片后利用ZEISS LSM700，选取405和488 nm 2个通道进行roGFP1观察和拍摄，随后加入10 mmol/L H2O2处理5～10 min并拍摄图像，完毕后吸去H2O2溶液，加入2 mmol/L DTT溶液处理5～10 min再次拍摄图像。
1.2.4农杆菌介导转化玉米幼胚。用pCAMBIA1304PubiroGFP1Tnos载体转化C58C1农杆菌获得转化菌株；用该转化菌株菌液浸染综31野生型玉米幼胚，经过共培养后，转入到含潮霉素B（Hygromycin B）的选择培养基上进行筛选，将诱导分化的玉米幼苗移栽至大棚继续培养。
1.2.5PCR 和Southern Blot鉴定转基因植株。PCR鉴定所用引物为FWhyg和RV35S（表1），条件为变性温度95 ℃，45 s，退火温度60 ℃，40 s，延伸温度72 ℃，1 min，30个循环，阳性植株PCR产物应出现大小为542 bp，然后荧光观察玉米叶片。结合两者的初步鉴定，将筛选出的玉米材料做Southern Blot鉴定，大致过程如下：利用roGFPF和roGFPR（表1）扩增出roGFP1基因特异的探针；用CTAB法大量提取玉米基因组DNA，Hind III 酶切40 V电泳过夜后将凝胶进行酸碱变性，利用毛细管碱性转移法转膜18 h，将膜80 ℃烤箱烘烤2 h后进行预雜交，2 h后用同位素标记的roGFP1探针进行杂交试验，18 h后洗膜和压片。
1.2.6统计分析。利用ImageJ软件对图片进行处理，荧光强度比值计算过程如前所述[8]。
2结果与分析
2.1RoGFP1探针响应H2O2和DTT引起的玉米幼胚氧化还原状态改变为了探究roGFP1探针是否响应玉米体内氧化还原状态的改变，试验利用基因枪介导转化法在玉米幼胚中瞬时表达roGFP1基因，通过激光共聚焦显微镜观察不同氧化还原处理下幼胚中的405和488 nm荧光强度并计算比值。结果发现，roGFP1基因能在玉米幼胚中成功表达；向幼胚切片中先后加入10 mmol/L H2O2溶液roGFP1探针迅速被氧化，荧光强度比值从0.844升高至1.837，而再加入2 mmol、L DTT溶液后roGFP1探针又被还原，荧光强度比值下降至0.911（图2）。这表明roGFP1基因能够在玉米幼胚中成功表达，并且对幼胚细胞内的可逆性氧化还原状态改变作出响应。
注：（A）为未处理的玉米幼胚；比值的颜色代表roGFP1的氧化还原状态，蓝色表示roGFP1的完全还原状态，黄色表示roGFP1的完全氧化状态；（B）为经10 mmol/LH2O2溶液处理的幼胚；（C）为经2 mmol/LDTT溶液处理的幼胚；Scale bar=300 pixel。
roGFP探针在众多植物细胞中的研究备受关注，然而在玉米中还缺乏研究。试验首先通过在Hi II植株授粉后20 d的玉米幼胚中瞬时表达roGFP1基因试验证实，roGFP1能够在玉米中响应H2O2和DTT引起的可逆性氧化还原状态改变，这与Meyer[8]利用roGFP2探针在拟南芥根中的研究结果相吻合。试验随后利用农杆菌浸染综31玉米幼胚，诱导分化的玉米幼苗经荧光显微镜观察和Southern Blot鉴定后存在阳性植株，表明roGFP1基因已经整合到玉米基因组中。