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摘要油菜的遗传转化研究已日趋成熟,用于转化的目的基因趋于多样化,如品质改良、抗病、抗逆、不育基因等;较常用的筛选标记基因是新霉素磷酸转移酶基因(NPT Ⅱ);目前用于油菜基因转化的方法有根癌农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、激光微束穿刺法、显微注射法和花粉介导法等。主要从油菜筛选标记及转化方法方面进行综述,并对油菜转基因上存在的问题及前景进行了探讨和展望。
关键词油菜;转化基因;筛选标记;转化方法
中图分类号S565.403.2文献标识码A文章编号 1007-5739(2010)09-0080-02
AdvanceofStudiesonTransgenicBrassicanapus
LIU XiaoJING Yin
(Rape Research Center of Beijing Forestry University,Beijing 100083)
AbstractHeredity transform research of rape is more and more matcher.Transgenics are tending to diversify,as follows:quality reformation,resistant to disease,pests and adverse etc.Selection marker used is NPTⅡ.At present,there are several methods of transformation in rape,including tumefaciens-medidated genetic etc,particle gun,PEG untake,vialaser microbeam puncture and microinjection.The foundation of rape selection marker and transformation methods were mainly summarizes in the paper. The present status of rapeseed genetic transformation were reviewed and the problems and envision for further study were discussed.
Key wordsBrassica napus;transgene selection marker;transformation method
油菜是世界四大油料作物之一,属十字花科(cruciferae)芸墓属(Brassica),主要包括甘蓝型油菜(B.napus)、芥菜型油菜(B.Juncea)和白菜型油菜(B.rapa)3个栽培种。随着生物技术的发展,将目标基因直接导入油菜以改良其生物性状已成为当前油菜育种研究的热点。芸薹属植物遗传转化的主要方法有农杆菌介导法、电激法、基因枪法、激光微束穿刺法等,由于对农杆菌的敏感性,农杆菌介导法已成为油菜等芸薹属植物基因转化中最常用的方法。迄今为止,已先后在甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜等作物上,实现了报告基因、抗除草剂基因、抗虫基因、抗病基因、雄性不育基因、改良蛋白组分基因等的遗传转化。笔者重点对转化目的基因、筛选标记和转化方法几个方面的进展进行综述。
1转化的目的基因
转基因油菜的育种研究一开始向着应用化的方向而进行,育种目标主要包括油菜品质改良(如:改变脂肪酸组分、提高含油量、改良油的品质、种子贮藏蛋白、低纤维素含量等)、抗性改良(如除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性、抗虫性)。经不完全统计,截至目前已有40多种基因转入油菜。
1.1转化品质改良基因
1.1.1油菜种子贮藏蛋白的遗传改良。通常情况下,种子中的油脂和蛋白质占有量分别为40%和20%,种子中的贮藏蛋白主要为napin和cruciferin。Kohno-Murase等[1]将编码napin蛋白的反义基因导入westar,发现转基因后代种子中crudiferin的含量比对照提高了1.4~1.5倍,但蛋白质的增加并没有影响种子脂肪酸的含量。
1.1.2油菜脂肪酸的遗传改良。芥酸(22∶1)及其衍生物是塑料膜生产行业中重要的可再生原料,Vesna Katavic将拟南芥的FAE1基因和酵母的SLC1-1基因导入甘蓝型油菜使芥酸含量有所提高[2]。Kohno-murase等报道,将反义napin基因导入油菜,降低了脂肪酸含量,提高了亚麻酸含量,硫脂酶基因的导入使中链脂肪酸含量达到75%,同时硫甙含量降低[3]。
1.2转化抗性基因
1.2.1转化抗除草剂基因。目前利用转基因技术已经培育出许多抗除草剂的油菜品种,主要利用的基因为Bar基因[4]、Pat基因和aroA基因[5]等。美国孟山托(Monsanto)公司从大肠杆菌的一个突变株中克隆出抗草甘膦的EPSP合成酶基因,并将其导入到油菜中,得到抗草甘膦除草剂的油菜;另一种是抗草丁膦除草剂基因,由加拿大等国育成,由抗性基因bar和pat共同整合抗草丁膦基因转入油菜,育成油菜新品种,并已进入田间试验[6]。Miki报道在Arabidopsis中克隆出Ahyclroxyacid合成酶基因(AHAS)突变体,并将其导入油菜,使油菜产生对咪唑基除草剂的抗性,钟蓉等[7]将抗除草剂溴苯腈基因bxn转入油菜获得抗溴苯腈转基因植株。
1.2.2转化抗病虫基因。油菜抗病虫转基因可分成抗虫、抗真菌和抗病毒3种基因。在抗虫方面,现在主要是利用从苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)中分离的杀虫晶体蛋白(crylass)基因(即BT)通过农杆菌介导转化导入油菜。在抗真菌方面,主要是利用从1种豆类作物(Phaseolusvulgaris)或番茄中克隆出的几丁质酶(chitinase)基因和从大麦中克隆的草酸氧化酶(oxalateoxidase)基因。
2筛选标记
油菜较常用的筛选标记基因有新霉素磷酸转移酶基因(NPT IⅡ),潮霉素磷酸转移酶基因[8]和二氢叶酸还原酶基因[9]及bar基因、spt基因[10]等,它们分别介导对卡那霉素、潮霉素、氨基喋呤、除草剂、巴龙霉素的抗性。筛选剂最常用的是卡那霉素,应用卡那霉素筛选不乏成功的报道[8,10],但有的学者认为[9],卡那霉素对甘蓝型油菜有时效果很差,这可能与基因型有关。潮霉素、庆大霉素、新霉素应用成功的报道亦不少[11-12]。Schroder等(1994)研究了在甘蓝型油菜转化过程中4种选择标记基因(npt Ⅱ,aadA,bar,spt)在筛选过程中的效果,认为aadA基因(介导对链霉素和壮观霉素的抗性)在转化体的筛选过程中是最合适的。
3油菜转基因方法
在植物基因工程研究中,关键步骤之一是通过特定的方法将外源基因导入受体植物细胞内,使之发生定向的、永久性的遗传变异,即所谓的植物遗传转化。为了方便有效地将外源基因导入植物体内,人们不断地探索、发展新的植物遗传转化方法。目前应用到油菜转基因中的遗传转化方法主要有农杆菌介导转化法和外源基因直接导入法。
3.1转化法
农杆菌在侵染植物伤口时,农杆菌在侵染植物伤口时,可将其携带质粒上的一段DNA(T-DNA)整合到植物基因组上,并在植物体内表达。因此,农杆菌作为一种天然载体系统被广泛应用到植物基因转化中,成为植物基因转化的首选方法。农杆菌介导的转基因方法具有以下优点:不需要专门仪器;宿主范围广,包括大多数双子叶植物和少数单子叶植物;插入外源基因的片段较大,可达50 kb以上;转化率明显高于其他直接转化方法;外源基因整合到植物基因组上的拷贝数较少,多为单拷贝;整合的外源基因变异小,后代的分离规律也遵循孟德尔遗传规律。缺点是仍受宿主范围和菌株特异性等因素的限制[13]。
3.2外源基因直接导入法
在油菜的遗传转化中,越来越多的研究倾向于采用外源基因直接转化法,因其不受宿主范围的限制,也不需用特定的载体。在早期的油菜遗传转化研究中取得成功的方法有3种:电激法、PEG法和显微注射法。近年发展起来的还有基因枪法、激光微束穿刺法、真空渗入遗传转化法。
3.2.1电激法。电激法是利用高压电脉冲作用,在原生质体膜上“电击穿孔”,形成可逆的瞬间通道,从而促进外源DNA的摄入,此法在动物细胞中应用较早,并取得了很好的效果。Guerche等[14]利用此法将含卡那霉素抗性基因nptⅡ导入甘蓝型油菜中。自此,电激穿孔法先后在烟草、玉米、水稻、马铃薯、番茄、大豆、小麦等作物原生质体上获得成功。
3.2.2显微注射法。显微注射法是使用专门的仪器将外源基因直接注入到生物的生殖细胞中,而获得转基因再生植株的一种方法。显微注射法多年前在动物中就已获得成功,由此促进了它在植物细胞中的应用。Neuhaus等[15]以甘蓝型油菜的花粉胚为受体,利用显微注射法将nptⅡ基因的外源DNA注入细胞中。但这一方法需以精细的显微操作技术和细胞低密度培养为基础,并且必须建立固定植物细胞或原生质体的技术。
3.2.3基因枪法。基因枪法是利用高压作用将包被外源DNA的微小金粒或钨粒高速射入受体细胞或组织,使外源DNA进入植物细胞并整合到植物染色体组中,从而达到稳定遗传和表达的目的。Fukuoka等[16]利用基因枪法转化甘蓝型油菜小孢子并获得可育的转化植株。
3.2.4激光微束穿刺法。激光微束穿刺法是利用聚焦到微米级的激光微束对组织进行穿刺,引起细胞膜的可逆性穿孔,从而导入外源DNA的一种基因直接转化技术。张海燕等[12]利用激光微束穿刺法将商陆(Phytolacca)抗病毒蛋白基因导入油菜双低品种H165,获得了转基因植株。
3.2.5PEG法。PEG介导法由Davey等和Krens等首先建立,主要原理是借助细胞融合剂诱导原生质体摄取外源DNA。Rasmussen等[17]通过PEG介导法将Gus基因导入油菜line的原生质体,研究认为PEG浓度是影响转化效率的关键因素。
4展望
4.1提高转基因油菜的遗传转化率
油菜遗传转化体系在不断完善,但现有的遗传转化率较低,作为一个实用性强的转化体系应具备简单、快速及高效等特点,这样它才能被应用到更多的油菜品种的研究中。
4.2提高转基因油菜外源基因的表达调控及其遗传稳定性
目前在油菜的遗传转化中,外源基因的插入整合基本上是随机的,其表达水平、表达部位及时间也大多不受控制,因此对外源基因的表达调控基本上处于失控状态。另外,还有由于外源基因的随机插入及拷贝数高而引起转基因沉默现象。解决这些问题就需要深入研究植物的生长发育机理,采用特定的启动子,使用植物偏好密码子,研究及应用定点插入技术等方法。
5参考文献
[1] KOHNO-MURASE J,MURSE M,ICHIKAWAH,et al.Effect of antisense napin gene of seed storage compounds in transgenic Brassica napus seeds[J].Plant Mol Biol,1994(26):1115-1124.
[2] VESNA KATAVIC,WINNIE FRIESEN.利用拟南芥的FAE1基因和酵母的SLC1-1基因通过生物技术提高油菜芥酸含量的尝试[J].国外作物育种,2001,20(4):37-44.
[3] 官春云,李恂.转基因油菜应用研究[J].细胞生物学杂志,1997,19(1):18-23.
[4] 林良斌.Bt 毒蛋白基因转化甘蓝型油菜的研究[D].长沙:湖南农业大学,1997.
[5] DALEY M.Co-transformation with one Agrobacterium tumefaciens strain containing two binary plasmids as a method for producing marker-free transgenic plants[J].Plant Cell Reports,1998(17):489-496.
[6] 孙万仓.转基因研究进展[J].西北农业学报,2000,9(3):117-121.
[7] 钟蓉,朱峰,刘玉乐,等.油菜的遗传转化及抗溴苯腈转基因油菜的获得[J].植物学报,1997,39 (1):22-27.
[8] 程振东,卫志明,许智宏.根癌农杆菌对甘蓝型油菜的转化及转基因植株的再生[J].植物学报,1994,36(9):657-663.
[9] PUA E C,MEHRA P,NAGY F,et al.Transgenic plants of Brassica napus L[J].Bio Technology,1987(5):815-817.
[10] 卫志明,黄健秋,徐淑平,等.甘蓝下胚轴的高效再生和农杆菌介导Bt基因转化甘蓝[J].上海农业学报,1998,14(2):11-18.
[11] 郎春秀,胡张华.油菜农杆菌转基因体系的建立及转PEP反义基因油菜的获得[J].浙江农业学报1999,11(2):55-58.
[12] 张海燕,周奕华,党本元,等.将商陆抗病毒蛋白(PAP)cDNA导入油菜获得抗病毒转基因植株[J].科学通报,1998,43(23):2534-2537.
[13] SANTAREM E R,TRICK H N,ESSIG J S,et al.Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation of soybean immature cotyledons:optimization of transient expression[J].Plant Cell Rep,1998(17):752-759.
[14] GUERCHE P,CHARBONNIER M,JOUANIN L,et al.Direct gene transfer by electro-poration in Brassica napus[J].Plant Sci,1987(52):111-116.
[15] NEUHAUS G,SPANGENBERG G,SCHEID O M,et al.Transgenic rap-eseed plants obtained by the microin-jection of DNA into microspore-derived embryoids[J].Theor Appl Genet,1998(75):30-36.
[16] FUKUOKA H,OGAWA T,MATSUOKA M,et al.Direct gene delivery into isolated microspores of rape-seed(Brassica napus L.)and the pro-duction of fertile trans-genic plants[J].Plant Cell Rep,1998,17(5):323-328.
[17] RASMUSSEN J O,RASMUSSEN O S.PEG mediated DNA uptake and transient Gus expression in carrot,rapeseed and soybean protoplants[J].Plant Sci,1993(89):199-207.
关键词油菜;转化基因;筛选标记;转化方法
中图分类号S565.403.2文献标识码A文章编号 1007-5739(2010)09-0080-02
AdvanceofStudiesonTransgenicBrassicanapus
LIU XiaoJING Yin
(Rape Research Center of Beijing Forestry University,Beijing 100083)
AbstractHeredity transform research of rape is more and more matcher.Transgenics are tending to diversify,as follows:quality reformation,resistant to disease,pests and adverse etc.Selection marker used is NPTⅡ.At present,there are several methods of transformation in rape,including tumefaciens-medidated genetic etc,particle gun,PEG untake,vialaser microbeam puncture and microinjection.The foundation of rape selection marker and transformation methods were mainly summarizes in the paper. The present status of rapeseed genetic transformation were reviewed and the problems and envision for further study were discussed.
Key wordsBrassica napus;transgene selection marker;transformation method
油菜是世界四大油料作物之一,属十字花科(cruciferae)芸墓属(Brassica),主要包括甘蓝型油菜(B.napus)、芥菜型油菜(B.Juncea)和白菜型油菜(B.rapa)3个栽培种。随着生物技术的发展,将目标基因直接导入油菜以改良其生物性状已成为当前油菜育种研究的热点。芸薹属植物遗传转化的主要方法有农杆菌介导法、电激法、基因枪法、激光微束穿刺法等,由于对农杆菌的敏感性,农杆菌介导法已成为油菜等芸薹属植物基因转化中最常用的方法。迄今为止,已先后在甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜等作物上,实现了报告基因、抗除草剂基因、抗虫基因、抗病基因、雄性不育基因、改良蛋白组分基因等的遗传转化。笔者重点对转化目的基因、筛选标记和转化方法几个方面的进展进行综述。
1转化的目的基因
转基因油菜的育种研究一开始向着应用化的方向而进行,育种目标主要包括油菜品质改良(如:改变脂肪酸组分、提高含油量、改良油的品质、种子贮藏蛋白、低纤维素含量等)、抗性改良(如除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性、抗虫性)。经不完全统计,截至目前已有40多种基因转入油菜。
1.1转化品质改良基因
1.1.1油菜种子贮藏蛋白的遗传改良。通常情况下,种子中的油脂和蛋白质占有量分别为40%和20%,种子中的贮藏蛋白主要为napin和cruciferin。Kohno-Murase等[1]将编码napin蛋白的反义基因导入westar,发现转基因后代种子中crudiferin的含量比对照提高了1.4~1.5倍,但蛋白质的增加并没有影响种子脂肪酸的含量。
1.1.2油菜脂肪酸的遗传改良。芥酸(22∶1)及其衍生物是塑料膜生产行业中重要的可再生原料,Vesna Katavic将拟南芥的FAE1基因和酵母的SLC1-1基因导入甘蓝型油菜使芥酸含量有所提高[2]。Kohno-murase等报道,将反义napin基因导入油菜,降低了脂肪酸含量,提高了亚麻酸含量,硫脂酶基因的导入使中链脂肪酸含量达到75%,同时硫甙含量降低[3]。
1.2转化抗性基因
1.2.1转化抗除草剂基因。目前利用转基因技术已经培育出许多抗除草剂的油菜品种,主要利用的基因为Bar基因[4]、Pat基因和aroA基因[5]等。美国孟山托(Monsanto)公司从大肠杆菌的一个突变株中克隆出抗草甘膦的EPSP合成酶基因,并将其导入到油菜中,得到抗草甘膦除草剂的油菜;另一种是抗草丁膦除草剂基因,由加拿大等国育成,由抗性基因bar和pat共同整合抗草丁膦基因转入油菜,育成油菜新品种,并已进入田间试验[6]。Miki报道在Arabidopsis中克隆出Ahyclroxyacid合成酶基因(AHAS)突变体,并将其导入油菜,使油菜产生对咪唑基除草剂的抗性,钟蓉等[7]将抗除草剂溴苯腈基因bxn转入油菜获得抗溴苯腈转基因植株。
1.2.2转化抗病虫基因。油菜抗病虫转基因可分成抗虫、抗真菌和抗病毒3种基因。在抗虫方面,现在主要是利用从苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)中分离的杀虫晶体蛋白(crylass)基因(即BT)通过农杆菌介导转化导入油菜。在抗真菌方面,主要是利用从1种豆类作物(Phaseolusvulgaris)或番茄中克隆出的几丁质酶(chitinase)基因和从大麦中克隆的草酸氧化酶(oxalateoxidase)基因。
2筛选标记
油菜较常用的筛选标记基因有新霉素磷酸转移酶基因(NPT IⅡ),潮霉素磷酸转移酶基因[8]和二氢叶酸还原酶基因[9]及bar基因、spt基因[10]等,它们分别介导对卡那霉素、潮霉素、氨基喋呤、除草剂、巴龙霉素的抗性。筛选剂最常用的是卡那霉素,应用卡那霉素筛选不乏成功的报道[8,10],但有的学者认为[9],卡那霉素对甘蓝型油菜有时效果很差,这可能与基因型有关。潮霉素、庆大霉素、新霉素应用成功的报道亦不少[11-12]。Schroder等(1994)研究了在甘蓝型油菜转化过程中4种选择标记基因(npt Ⅱ,aadA,bar,spt)在筛选过程中的效果,认为aadA基因(介导对链霉素和壮观霉素的抗性)在转化体的筛选过程中是最合适的。
3油菜转基因方法
在植物基因工程研究中,关键步骤之一是通过特定的方法将外源基因导入受体植物细胞内,使之发生定向的、永久性的遗传变异,即所谓的植物遗传转化。为了方便有效地将外源基因导入植物体内,人们不断地探索、发展新的植物遗传转化方法。目前应用到油菜转基因中的遗传转化方法主要有农杆菌介导转化法和外源基因直接导入法。
3.1转化法
农杆菌在侵染植物伤口时,农杆菌在侵染植物伤口时,可将其携带质粒上的一段DNA(T-DNA)整合到植物基因组上,并在植物体内表达。因此,农杆菌作为一种天然载体系统被广泛应用到植物基因转化中,成为植物基因转化的首选方法。农杆菌介导的转基因方法具有以下优点:不需要专门仪器;宿主范围广,包括大多数双子叶植物和少数单子叶植物;插入外源基因的片段较大,可达50 kb以上;转化率明显高于其他直接转化方法;外源基因整合到植物基因组上的拷贝数较少,多为单拷贝;整合的外源基因变异小,后代的分离规律也遵循孟德尔遗传规律。缺点是仍受宿主范围和菌株特异性等因素的限制[13]。
3.2外源基因直接导入法
在油菜的遗传转化中,越来越多的研究倾向于采用外源基因直接转化法,因其不受宿主范围的限制,也不需用特定的载体。在早期的油菜遗传转化研究中取得成功的方法有3种:电激法、PEG法和显微注射法。近年发展起来的还有基因枪法、激光微束穿刺法、真空渗入遗传转化法。
3.2.1电激法。电激法是利用高压电脉冲作用,在原生质体膜上“电击穿孔”,形成可逆的瞬间通道,从而促进外源DNA的摄入,此法在动物细胞中应用较早,并取得了很好的效果。Guerche等[14]利用此法将含卡那霉素抗性基因nptⅡ导入甘蓝型油菜中。自此,电激穿孔法先后在烟草、玉米、水稻、马铃薯、番茄、大豆、小麦等作物原生质体上获得成功。
3.2.2显微注射法。显微注射法是使用专门的仪器将外源基因直接注入到生物的生殖细胞中,而获得转基因再生植株的一种方法。显微注射法多年前在动物中就已获得成功,由此促进了它在植物细胞中的应用。Neuhaus等[15]以甘蓝型油菜的花粉胚为受体,利用显微注射法将nptⅡ基因的外源DNA注入细胞中。但这一方法需以精细的显微操作技术和细胞低密度培养为基础,并且必须建立固定植物细胞或原生质体的技术。
3.2.3基因枪法。基因枪法是利用高压作用将包被外源DNA的微小金粒或钨粒高速射入受体细胞或组织,使外源DNA进入植物细胞并整合到植物染色体组中,从而达到稳定遗传和表达的目的。Fukuoka等[16]利用基因枪法转化甘蓝型油菜小孢子并获得可育的转化植株。
3.2.4激光微束穿刺法。激光微束穿刺法是利用聚焦到微米级的激光微束对组织进行穿刺,引起细胞膜的可逆性穿孔,从而导入外源DNA的一种基因直接转化技术。张海燕等[12]利用激光微束穿刺法将商陆(Phytolacca)抗病毒蛋白基因导入油菜双低品种H165,获得了转基因植株。
3.2.5PEG法。PEG介导法由Davey等和Krens等首先建立,主要原理是借助细胞融合剂诱导原生质体摄取外源DNA。Rasmussen等[17]通过PEG介导法将Gus基因导入油菜line的原生质体,研究认为PEG浓度是影响转化效率的关键因素。
4展望
4.1提高转基因油菜的遗传转化率
油菜遗传转化体系在不断完善,但现有的遗传转化率较低,作为一个实用性强的转化体系应具备简单、快速及高效等特点,这样它才能被应用到更多的油菜品种的研究中。
4.2提高转基因油菜外源基因的表达调控及其遗传稳定性
目前在油菜的遗传转化中,外源基因的插入整合基本上是随机的,其表达水平、表达部位及时间也大多不受控制,因此对外源基因的表达调控基本上处于失控状态。另外,还有由于外源基因的随机插入及拷贝数高而引起转基因沉默现象。解决这些问题就需要深入研究植物的生长发育机理,采用特定的启动子,使用植物偏好密码子,研究及应用定点插入技术等方法。
5参考文献
[1] KOHNO-MURASE J,MURSE M,ICHIKAWAH,et al.Effect of antisense napin gene of seed storage compounds in transgenic Brassica napus seeds[J].Plant Mol Biol,1994(26):1115-1124.
[2] VESNA KATAVIC,WINNIE FRIESEN.利用拟南芥的FAE1基因和酵母的SLC1-1基因通过生物技术提高油菜芥酸含量的尝试[J].国外作物育种,2001,20(4):37-44.
[3] 官春云,李恂.转基因油菜应用研究[J].细胞生物学杂志,1997,19(1):18-23.
[4] 林良斌.Bt 毒蛋白基因转化甘蓝型油菜的研究[D].长沙:湖南农业大学,1997.
[5] DALEY M.Co-transformation with one Agrobacterium tumefaciens strain containing two binary plasmids as a method for producing marker-free transgenic plants[J].Plant Cell Reports,1998(17):489-496.
[6] 孙万仓.转基因研究进展[J].西北农业学报,2000,9(3):117-121.
[7] 钟蓉,朱峰,刘玉乐,等.油菜的遗传转化及抗溴苯腈转基因油菜的获得[J].植物学报,1997,39 (1):22-27.
[8] 程振东,卫志明,许智宏.根癌农杆菌对甘蓝型油菜的转化及转基因植株的再生[J].植物学报,1994,36(9):657-663.
[9] PUA E C,MEHRA P,NAGY F,et al.Transgenic plants of Brassica napus L[J].Bio Technology,1987(5):815-817.
[10] 卫志明,黄健秋,徐淑平,等.甘蓝下胚轴的高效再生和农杆菌介导Bt基因转化甘蓝[J].上海农业学报,1998,14(2):11-18.
[11] 郎春秀,胡张华.油菜农杆菌转基因体系的建立及转PEP反义基因油菜的获得[J].浙江农业学报1999,11(2):55-58.
[12] 张海燕,周奕华,党本元,等.将商陆抗病毒蛋白(PAP)cDNA导入油菜获得抗病毒转基因植株[J].科学通报,1998,43(23):2534-2537.
[13] SANTAREM E R,TRICK H N,ESSIG J S,et al.Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation of soybean immature cotyledons:optimization of transient expression[J].Plant Cell Rep,1998(17):752-759.
[14] GUERCHE P,CHARBONNIER M,JOUANIN L,et al.Direct gene transfer by electro-poration in Brassica napus[J].Plant Sci,1987(52):111-116.
[15] NEUHAUS G,SPANGENBERG G,SCHEID O M,et al.Transgenic rap-eseed plants obtained by the microin-jection of DNA into microspore-derived embryoids[J].Theor Appl Genet,1998(75):30-36.
[16] FUKUOKA H,OGAWA T,MATSUOKA M,et al.Direct gene delivery into isolated microspores of rape-seed(Brassica napus L.)and the pro-duction of fertile trans-genic plants[J].Plant Cell Rep,1998,17(5):323-328.
[17] RASMUSSEN J O,RASMUSSEN O S.PEG mediated DNA uptake and transient Gus expression in carrot,rapeseed and soybean protoplants[J].Plant Sci,1993(89):199-207.