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摘要：目的：脐带血间充质干细胞移植对大鼠心肌病的影响。方法：采用阿霉素诱导大鼠心肌病模型，提取脐血间充质干细胞，尾静脉注射进行治疗，10 d后处死大鼠，检测炎症介质与心肌酶等指标。结果：心肌病模型大鼠心肌组织坏死面积明显增大，肿瘤坏死因子-a、白介素-6、白介素-10、B型脑钠利肽、心脏I型胶原含量均显著升高，肌酸激酶和同工酶、天门冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶含量均显著升高。脐血间充质干细胞治疗后，大鼠心肌组织坏死面积明显缩小，肿瘤坏死因子-a、白介素-6、白介素-10、B型脑钠利肽、心脏I型胶原含量均显著下降，肌酸激酶和同工酶、天门冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶含量均显著下降。结论：脐血间充质干细胞是治疗阿霉素诱导的大鼠心肌病的一种新方法。
关键词：脐血间充质干细胞，阿霉素，心肌病，心肌功能，移植
脐带血干细胞（MSCs）具有多向分化的优势和强大自我更新潜能，且来源丰富、易于采集、对供者无伤害、不受倫理及法律限制、分化性强、免疫原性低等优势，是治疗心血管疾病的研究热点[1]。本研究成功建立了高剂量阿霉素诱导的大鼠心肌病模型，检测MSCs治疗前后血浆细胞因子水平、心肌I型胶原比例、心肌酶表达及B型脑钠利肽（BNP）水平，为MSCs治疗心肌病提供临床依据。现报道如下：
1资料与方法
1.1 实验动物
8周龄雄性Wistar-Kyoto大鼠，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。单独饲养，自由进食和饮水。放置在相对湿度40%～70%、温度20℃～25℃的房间中，每小时换气10～15次。光照时间为23：15～11：15 h，光照强度为60～80 lux。随机分为WKY对照组（WKY-C）、WKY-ADR模型组（WKY-M）和WKY心肌病治疗组（WKY-T），每组20只。WKY-C组给予正常复合饲料，0.9%生理盐水腹腔注射，1次/周，共10周。WKY-M组给予正常饲料（不含ADR），腹腔注射阿霉素（ADR），2.5 mg/kg，1次/周，持续10周。WKY-T组给予正常饲料（不含ADR），腹腔注射ADR，2.5 mg/kg，1次/周，持续10周，采用尾静脉注射脐带血MSCs（108 cells ml，100 μl）。
1.2 MSCs培养
取自无菌条件下自然出生或剖腹产的健康婴儿。收取脐带血，肝素抗凝，将脐带血与D-hanks液按1：1比例混合，慢慢加入淋巴分离液中。稀释后的脐血和人淋巴细胞分离液以2000 r/min离心20 min，提取白膜层MSCs。MSCs加入D-hanks液，1000 r/min离心5 min，弃上清。采用低糖DMEM （DMEM-LG，pH7.4）或Mesencult培养基培养。绘制原代脐血MSCs和P2脐血MSCs的生长曲线。在倒置显微镜下对培养的脐带血MSCs进行观察和拍照。选择生长良好的P2脐血间充质干细胞制备细胞悬液，CD11b、CD29、CD34、CD45、CD90荧光标记，流式细胞仪分析染色细胞。
1.3 大鼠心功能测定
腹腔注射戊巴比妥钠溶液（35 mg/kg）麻醉法术。测量大鼠心功能，包括左心室舒张末期尺寸（LVEDd）、左心室收缩舒张末期内径（LVESd）、左心室射血分数（LVEF）和左心室短缩率（LVFS）。
1.4 HE染色
取心脏标本，10%福尔马林固定，包埋，切成4 μm薄片。苏沐瑾和伊红染色分析。
1.5 ELISA检测
大鼠眼眶取血，110 g离心10 min，-20℃保存。ELISA试剂盒检测肿瘤坏死因子-a（TNF-a）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、B型脑纳肽（BNP）、心脏I型胶原含量。
1.6 心肌酶检测
试剂盒购自南京建成生物工程研究所，检测心肌天门冬氨酸转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）和同工酶（CK- mb）含量。
1.7 Masson染色
试剂盒购自上海波谷生物技术有限公司。Masson染色观察心肌胶原。
2统计学分析
数据均以平均值的标准误差（SEM）表示。采用GraPHPad Prism，student’s双尾未配对t检验进行分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
3结果
3.1 MSCs鉴定
原代培养7 d后，脐血间充质干细胞由圆形变为梭形。随着培养时间的延长，贴壁生长细胞逐渐减少，形成集落，细胞呈漩涡状排列。4周后脐血MSCs可融合成单层细胞，5～7 d即可基本覆盖瓶底。P2的MSCs形态均匀，没有明显变化（见图1A）。MSCs接种后第1 d和第2 d细胞增殖无明显变化。从第三天起MSCs细胞的数量急剧增加，呈现对数生长，在6～7 d达到增长高峰。原代和P2细胞的生长曲线基本一致，表明传代后细胞仍能保持良好的生长速率（见图1B）。此外，这些MSCs均呈CD11b、CD29、CD90阳性表达，CD34、CD45表达阴性，并有向成骨细胞、脂肪细胞和肌肉细胞分化的潜能（见图1C）。
3.2 WKY-C组与模型组左室各指标对比
排除在建立心肌病模型过程中死亡的大鼠。模型组动物在心肌病发生10周后，左室LVEDd、LVESd、LVEF、LVFS高与WKY-C组（P<0.01），提示心功能下降。见表1。
3.3 造模前后因子表达变化
与WKY-C组相比，WKY-M组大鼠心脏心脏I型胶原含量、BNP水平、心脏AST水平、LDH、心肌酶CK、CK-mb、IL-6、IL-10、TNF-a水平均升高，差异有统计学意义（P<0.5）。
3.4 MSCs移植后心功能变化 与WKY-C组相比，模型组动物左室各指标升高，差异有统计学意义（P<0.05），MSCs移植后，左室各指标均下降，差异有统计学意义（P<0.05），提示心功能恢复。
3.5 MSCs移植后因子变化
与WKY-C组相比，WKY-M组大鼠心脏I型胶原含量水平升高（P<0.01），MSCs移植后，大鼠心脏I型胶原含量水平降低（P<0.5）。与WKY-C组相比，WKY-M组大鼠心脏BNP水平升高（P<0.01），MSCs移植后，大鼠心脏BNP水平降低（P<0.5）。与WKY-C组相比，WKY-M组大鼠心脏AST水平、LDH水平、心肌酶CK、CK-mb水平升高，差异有统计学意义（P<0.5），MSCs移植后均降低。与WKY-C组相比，WKY-M组大鼠血清炎症介质IL-6、IL-10、TNF-a水平升高，差异有统计学意义（P<0.5），MSCs移植后均降低（P<0.5）。
4讨论
ADR诱导心肌病模型的病理、血流动力学和激素变化与人类充血性心力衰竭的表现类似。因此，本研究建立了ADR心肌病大鼠模型，为分析心肌病的发病机制、心力衰竭及新的治疗措施提供基础[2]。
心脏胶原蛋白是心脏间质的重要成分，其形态改变以及各种胶原蛋白的比例变化对心脏功能也有重要影响。许多心脏病与胶原蛋白比例失衡密切相关，目前，心肌胶原蛋白的形态结构、调控机制以及与心肌功能的关系已引起国內外学者的关注。研究发现，WKY-M诱导心脏I型胶原水平升高，说明心脏功能下降。
BNP是目前诊断心肌病最有效的血清学指标。研究发现，与WKY-C组相比，WKY-M组血清BNP升高。同时，WKY-M组心肌组织坏死面积明显增大。血清心肌酶的测定对心肌病的诊断和治疗评价具有重要价值。ADR导致心肌酶CK、CK-mb、AST和LDH水平升高，与心功能下降结果相一致。WKY-M组心肌病导致血清促炎因子IL-6、TNF-a和抗炎因子IL-10水平升高。提示心肌病可诱导促炎和抗炎因子失衡，从而介导免疫或炎症反应。
研究结果显示，脐血MSCs移植可以改善受损心脏局部和整体的收缩或舒张功能。目前，移植细胞改善心脏功能的机制尚不清楚，其机制可能是脐血间充质干细胞诱导心肌再生和旁分泌效应。
参考文献
[1]韩小改，李建斌，单泓，等.两种状态脐血间充质干细胞移植对脑梗死大鼠神经功能恢复的对比研究[J].中国组织工程研究，2018，22（9）：1395-1401.
[2]柳爽爽，王本臻，毛成刚，等.人脐带间充质干细胞外泌体对多柔比星致扩张型心肌病大鼠心肌纤维化的影响[J].中华实用儿科临床杂志，2020，35（11）：842-846.
关键词：脐血间充质干细胞，阿霉素，心肌病，心肌功能，移植
脐带血干细胞（MSCs）具有多向分化的优势和强大自我更新潜能，且来源丰富、易于采集、对供者无伤害、不受倫理及法律限制、分化性强、免疫原性低等优势，是治疗心血管疾病的研究热点[1]。本研究成功建立了高剂量阿霉素诱导的大鼠心肌病模型，检测MSCs治疗前后血浆细胞因子水平、心肌I型胶原比例、心肌酶表达及B型脑钠利肽（BNP）水平，为MSCs治疗心肌病提供临床依据。现报道如下：
1资料与方法
1.1 实验动物
8周龄雄性Wistar-Kyoto大鼠，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。单独饲养，自由进食和饮水。放置在相对湿度40%～70%、温度20℃～25℃的房间中，每小时换气10～15次。光照时间为23：15～11：15 h，光照强度为60～80 lux。随机分为WKY对照组（WKY-C）、WKY-ADR模型组（WKY-M）和WKY心肌病治疗组（WKY-T），每组20只。WKY-C组给予正常复合饲料，0.9%生理盐水腹腔注射，1次/周，共10周。WKY-M组给予正常饲料（不含ADR），腹腔注射阿霉素（ADR），2.5 mg/kg，1次/周，持续10周。WKY-T组给予正常饲料（不含ADR），腹腔注射ADR，2.5 mg/kg，1次/周，持续10周，采用尾静脉注射脐带血MSCs（108 cells ml，100 μl）。
1.2 MSCs培养
取自无菌条件下自然出生或剖腹产的健康婴儿。收取脐带血，肝素抗凝，将脐带血与D-hanks液按1：1比例混合，慢慢加入淋巴分离液中。稀释后的脐血和人淋巴细胞分离液以2000 r/min离心20 min，提取白膜层MSCs。MSCs加入D-hanks液，1000 r/min离心5 min，弃上清。采用低糖DMEM （DMEM-LG，pH7.4）或Mesencult培养基培养。绘制原代脐血MSCs和P2脐血MSCs的生长曲线。在倒置显微镜下对培养的脐带血MSCs进行观察和拍照。选择生长良好的P2脐血间充质干细胞制备细胞悬液，CD11b、CD29、CD34、CD45、CD90荧光标记，流式细胞仪分析染色细胞。
1.3 大鼠心功能测定
腹腔注射戊巴比妥钠溶液（35 mg/kg）麻醉法术。测量大鼠心功能，包括左心室舒张末期尺寸（LVEDd）、左心室收缩舒张末期内径（LVESd）、左心室射血分数（LVEF）和左心室短缩率（LVFS）。
1.4 HE染色
取心脏标本，10%福尔马林固定，包埋，切成4 μm薄片。苏沐瑾和伊红染色分析。
1.5 ELISA检测
大鼠眼眶取血，110 g离心10 min，-20℃保存。ELISA试剂盒检测肿瘤坏死因子-a（TNF-a）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、B型脑纳肽（BNP）、心脏I型胶原含量。
1.6 心肌酶检测
试剂盒购自南京建成生物工程研究所，检测心肌天门冬氨酸转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）和同工酶（CK- mb）含量。
1.7 Masson染色
试剂盒购自上海波谷生物技术有限公司。Masson染色观察心肌胶原。
2统计学分析
数据均以平均值的标准误差（SEM）表示。采用GraPHPad Prism，student’s双尾未配对t检验进行分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
3结果
3.1 MSCs鉴定
原代培养7 d后，脐血间充质干细胞由圆形变为梭形。随着培养时间的延长，贴壁生长细胞逐渐减少，形成集落，细胞呈漩涡状排列。4周后脐血MSCs可融合成单层细胞，5～7 d即可基本覆盖瓶底。P2的MSCs形态均匀，没有明显变化（见图1A）。MSCs接种后第1 d和第2 d细胞增殖无明显变化。从第三天起MSCs细胞的数量急剧增加，呈现对数生长，在6～7 d达到增长高峰。原代和P2细胞的生长曲线基本一致，表明传代后细胞仍能保持良好的生长速率（见图1B）。此外，这些MSCs均呈CD11b、CD29、CD90阳性表达，CD34、CD45表达阴性，并有向成骨细胞、脂肪细胞和肌肉细胞分化的潜能（见图1C）。
3.2 WKY-C组与模型组左室各指标对比
排除在建立心肌病模型过程中死亡的大鼠。模型组动物在心肌病发生10周后，左室LVEDd、LVESd、LVEF、LVFS高与WKY-C组（P<0.01），提示心功能下降。见表1。
3.3 造模前后因子表达变化
与WKY-C组相比，WKY-M组大鼠心脏心脏I型胶原含量、BNP水平、心脏AST水平、LDH、心肌酶CK、CK-mb、IL-6、IL-10、TNF-a水平均升高，差异有统计学意义（P<0.5）。
3.4 MSCs移植后心功能变化 与WKY-C组相比，模型组动物左室各指标升高，差异有统计学意义（P<0.05），MSCs移植后，左室各指标均下降，差异有统计学意义（P<0.05），提示心功能恢复。
3.5 MSCs移植后因子变化
与WKY-C组相比，WKY-M组大鼠心脏I型胶原含量水平升高（P<0.01），MSCs移植后，大鼠心脏I型胶原含量水平降低（P<0.5）。与WKY-C组相比，WKY-M组大鼠心脏BNP水平升高（P<0.01），MSCs移植后，大鼠心脏BNP水平降低（P<0.5）。与WKY-C组相比，WKY-M组大鼠心脏AST水平、LDH水平、心肌酶CK、CK-mb水平升高，差异有统计学意义（P<0.5），MSCs移植后均降低。与WKY-C组相比，WKY-M组大鼠血清炎症介质IL-6、IL-10、TNF-a水平升高，差异有统计学意义（P<0.5），MSCs移植后均降低（P<0.5）。
4讨论
ADR诱导心肌病模型的病理、血流动力学和激素变化与人类充血性心力衰竭的表现类似。因此，本研究建立了ADR心肌病大鼠模型，为分析心肌病的发病机制、心力衰竭及新的治疗措施提供基础[2]。
心脏胶原蛋白是心脏间质的重要成分，其形态改变以及各种胶原蛋白的比例变化对心脏功能也有重要影响。许多心脏病与胶原蛋白比例失衡密切相关，目前，心肌胶原蛋白的形态结构、调控机制以及与心肌功能的关系已引起国內外学者的关注。研究发现，WKY-M诱导心脏I型胶原水平升高，说明心脏功能下降。
BNP是目前诊断心肌病最有效的血清学指标。研究发现，与WKY-C组相比，WKY-M组血清BNP升高。同时，WKY-M组心肌组织坏死面积明显增大。血清心肌酶的测定对心肌病的诊断和治疗评价具有重要价值。ADR导致心肌酶CK、CK-mb、AST和LDH水平升高，与心功能下降结果相一致。WKY-M组心肌病导致血清促炎因子IL-6、TNF-a和抗炎因子IL-10水平升高。提示心肌病可诱导促炎和抗炎因子失衡，从而介导免疫或炎症反应。
研究结果显示，脐血MSCs移植可以改善受损心脏局部和整体的收缩或舒张功能。目前，移植细胞改善心脏功能的机制尚不清楚，其机制可能是脐血间充质干细胞诱导心肌再生和旁分泌效应。
参考文献
[1]韩小改，李建斌，单泓，等.两种状态脐血间充质干细胞移植对脑梗死大鼠神经功能恢复的对比研究[J].中国组织工程研究，2018，22（9）：1395-1401.
[2]柳爽爽，王本臻，毛成刚，等.人脐带间充质干细胞外泌体对多柔比星致扩张型心肌病大鼠心肌纤维化的影响[J].中华实用儿科临床杂志，2020，35（11）：842-846.