秋水仙碱是一种强效生物碱，因其具有特殊的结构及药效，受到人们广泛的关注。多项研究都表明秋水仙碱体内血药浓度较低，因此对其检测分析方法的灵敏度要求较高。因此，本文建立了使用超高效液相色谱-高分辨质谱仪（UPLC-Q/Orbitrap HRMS）测定血样中秋水仙碱的检测方法。考察不同流动相和色谱柱对秋水仙碱分离效果的影响，结果表明在甲醇水体系作为流动相条件下，使用Accucore TM Phenyl-Hexyl（2.1 mm×100mm×2.6μm）色谱柱，仪器响应值高且分离效果较好。采用乙腈为蛋白沉淀剂，有机微孔过滤膜净化提取液，用UPLC-Q/Orbitrap HRMS对血样中秋水仙碱进行定性定量检验。分析采用Accucore TM Phenyl-Hexyl （2.1 mm×100 mm×2.6μm）色谱柱，电喷雾离子源正离子（FullMS/ddMS~2）模式，使用阶梯碰撞能量：35、60和85eV，用5 mmol/L甲酸铵水溶液和甲醇作为流动相梯度洗脱。本方法血样中的秋水仙碱定量限为0.5 ng/mL；秋水仙碱在0.5～100 ng/mL范围内线性良好（R~2=0.998 5）,3个浓度平均回收率为92.8%～98.3%，日内精密度为1.6%～7.1%（n=6）。文章建立的定性定量分析方法简易可靠，灵敏度高，适用于血样中秋水仙碱的检验鉴定。