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在众多的人类组织工程学体外模型皮肤中，皮肤组织的三维（3D）重组模型是其中最完善的模型之一。制药业和化妆品行业对于动物模型的替代方法巨大的需求，推动了皮肤模型的发展进步。2013年7月26日，经济合作与发展组织
（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）再次更新试验指南TG43l和TG439，对于使用3D皮肤模型进行体外皮肤腐蚀性、刺激性试验，提出更具体的要求。本篇综述重点介绍由角质细胞构成的重组表皮模型（Reconstructed Human Epidermis Made of Keratinocyte，RHE），概述其检测原理，以及OECD对于应用此类体外模型的最新标准。简单介绍其他种类的皮肤模型，并对我国目前动物试验替代方法的研究成果和前景进行讨论和总结。
关键词：皮肤模型，动物试验替代方法，OECD规则
引言
皮肤作为人类最大的器官，包含多种类型的细胞，这些细胞相互影响，协同作用，构成阻挡有害物质进入机体的第一道天然屏障。角质层作为皮肤屏障作用的主要执行者，是由表皮层基底的角质细胞不断分化而来（如图1）。在表皮层中，除了角质细胞，还有黑色素细胞和朗罕氏细胞。表皮层通过一层基膜与其下面的真皮层相连接。真皮层分为乳突层和网状层，前者含有的胶原纤维排列疏松，后者的胶原纤维排列致密并且与皮肤表面平行。这些胶原纤维由成纤维细胞产生，含有大量的弹性蛋白，为皮肤提供弹性。不同于表皮层没有血管的结构，真皮层内富含血管、淋巴管、神经、汗腺、皮脂腺和毛囊。
皮肤的疾病可能由多种原因造成，比如细胞代谢紊乱、传染病，对外界抗原的免疫性反应或是物理性、化学性的伤害。病因的多样性和复杂性使得在药物研发领域，对于体外皮肤模型的需要日益增长。另外，出于法律和道德的要求，国外化妆品行业同样重视体外皮肤模型的使用。2013年7月26日，经济合作与发展组织（Organization for Economic Co-operation andDevelopment.OECD）再次更新试验指南TG431和TG439（以下简称2013版指南），对于体外皮肤腐蚀性、刺激性试验提出更详尽的要求。
大量的研究促使人类皮肤模型不断进步，从依靠滋养层培养到表皮替代物以及多种类型细胞共培养系统。目前皮肤模型主要分为两大类，一类是致力于开发更为精细复杂的皮肤模型，用于皮肤疾病的治疗，培养条件和结果判定也相应的更复杂。已经建立的比较好的模型是包含有角质细胞和成纤维细胞的全皮模型（fullthickness.FT），还有更为复杂的加入了其他类型细胞（如黑色素细胞，干细胞，朗罕氏细胞）或者可以与其他器官相互作用的模型。第二类则是已经进入量产并且经过验证的由角质细胞构成的重组表皮模型，主要用于风险评估，具有很好的可重复性。本文将重点讨论第二类皮肤模型，并简单介绍其他模型。
由角质细胞构成的重组表皮模型
1.概况
为满足研究者和工业界对于皮肤模型不同的需求，现有的皮肤模型有多种类型。最基本的是只含角质细胞的皮肤模型，即由角质细胞构成的重组表皮模型（Reconstructed HumanEpidermis Made of Keratinocyte.RHE）。RHE是在特定条件下培养人类角质细胞，并通过气液面培养的方式得到角质层，基本具有类似于人表皮的组织结构（如图2）。
1998年，首批皮肤模型（EpiSkin和EpiDermTM）被替代方法欧洲研究中心（EuropeanCentre for the Validation of AlternativeMethods.ECVAM）批准用于皮肤腐蚀性预测，并于2004年随着OECD试验指南的出版而在国际上被广泛接受。不久之后，其他满足经合组织试验指南要求的模型陆续被批准。2008年经过调整的EpiDerm SIT和SkinEthic被批准用于皮肤刺激性预测。
2.检测原理
RHE对于有潜在腐蚀性或刺激性物质的预测是通过检测细胞存活率的方法来实现。即待检测物质渗透至角质层以下的细胞层，如果对活细胞产生毒性作用，就会导致部分细胞死亡。使用3-（4.5-二甲基噻唑-2）-2.5二苯基四氮唑溴盐（简称MTT）检测，根据试验组吸光值（OD值）和阴性对照组的比值，确定细胞活率的变化。当待测物质对于活细胞有刺激作用时，细胞会分泌系列迅速引起皮肤炎症的因子，如IL-1α，对其定量分析可以辅助评估细胞受到刺激的程度和体外炎症起始的级联反应/作用机理。所以对于刺激性物质通常会选用MTT和IL-1α双终点判定。
3.OECD 2013版指南对于皮肤模型的基本要求
RHE主要目的是对待测物质进行毒性预测和评估，所以必须保证试验结果的可重复性。在2013版试验指南中，OECD提出了皮肤模型的“执行标准”（performance standard），规定如果向OECD申请认证新的或类似的皮肤模型，必须符合此“执行标准”。其中关于皮肤模型的质量制定了五项基本标准，概况如下：
1）细胞活性：每批次的RHE必须达到规定的阴性对照标准，即细胞活率达到特定数值。不同生产商标准有所不同，如表1，OD值过低，说明RHE自身活细胞数目少，活率低，可能无法真实反应待测物质的腐蚀性或刺激性；相反，如果OD值太高，说明RHE细胞数量过多，可能对于毒性有耐受，同样无法获得真实结果。
2）屏障作用：角质层及其脂质结构产生的屏障作用能够在一定程度上抵挡特定有害物质的快速渗透。一般使用SDS或者1%Triton-100作用于RHE表面，计算细胞活率下降50%所需要的时间（ET50）或者剂量（C50），两个值需在定范围内（如表2），过低或者过高表明角质层太薄或者太厚，都不能真实预测待检物质的毒性作用。 3）组织结构：必须具备人表皮样结构，即有基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层。
4）可重复性：阳性对照和阴性对照的试验结果必须具有可重复性。
5）质量控制：需要将以上四点信息告知使用者，并保证每个批次的RHE各项指标均在规定范围内。
另外，“执行标准”中针对皮肤腐蚀性/刺激性试验。分别提供了参考化学品名录（MinimumList of Reference Chemicals）。并且更改了腐蚀性试验化学品的分类方法，由之前分为两类（腐蚀性和非腐蚀性）改为三类（1A、1B-and-1C、和NC），1A代表强腐蚀性，1B-and-lC代表中等腐蚀性，NC代表非腐蚀性（如表3）。刺激性试验化学品依旧分为两大类——刺激性和非刺激性（如表4）。
4.OECD 2013版指南对于试验操作的基本要求
对于应用RHE进行皮肤刺激性或腐蚀性试验操作，2013版指南也提出具体要求，简单概括以下几点：
1）每个待测品有2～3个皮肤组织作为重复。
2）根据待测品性质和皮肤组织面积规定最少用量。
3）根据待测品种类选择2个或3个暴露时问，对于刺激性化学品，一般暴露60分钟，清洗再培养42小时后检测；对于腐蚀性化学品，一般选择3分钟和60分钟两个时间点。
4）阴性对照可选择生理盐水或磷酸盐缓冲液。
其他类型的重组皮肤模型
1.全皮模型（Full ThicKness，FT）
全皮模型通常包含有角质细胞、成纤维细胞以及胶原基质。通常是由胶原蛋白和人的皮肤成纤维细胞结合形成基质，然后将角质细胞培养于基质之上，同样经过气液面培养形成角质层。与表皮模型十分明确的培养条件不同的是，全皮模型的培养过程中加入血清（为了成纤维细胞的存活）。血清作为种天然产物，每批次的各种蛋白含量，如生长因子，都有可能不同，从而导致全皮模型批次问的差异。但是全皮模型的角质层屏障作用更强，得到的结果与体内试验致性更好。
2.含有色素细胞的皮肤模型
由Duval等建立的含有色素细胞的皮肤模型，是迄今为止最为完善的且在生理学上被证明的皮肤模型。尽管黑色素细胞是最早被研究者试图加入到皮肤模型中的细胞，但是因为角质细胞参与调解黑色素细胞的附着、存活和形态，所以经历了将近30年，研究者才得到令人满意的模型。含有色素细胞的皮肤模型，一方面将帮助制药企业研发治疗白癜风等疾病的药物；另方面，将对化妆品企业研发美白产品起到帮助作用。
3.含有朗罕氏细胞的皮肤模型
因为皮肤是抵挡外界侵害的屏障，所以它也是免疫反应多发的部位。表皮中有促炎作用和免疫调节作用的细胞包括：角质细胞、黑色素细胞和上皮的树突状细胞（又名为朗罕氏细胞）。目前，对于含有朗罕氏细胞的皮肤模型，都集中于器官型培养，用于皮炎治疗等方面的研究。
国内重组皮肤模型前景
尽管人类皮肤模型在国外已经有40多年的发展历史，并已经形成法律规范，欧盟化妆品规程第7次修正案（2003/15/EC.2003）中规定，自2009年3月起在欧盟范围内禁止使用动物进行化妆品毒性和过敏试验，2013年起禁止使用动物进行化妆品原料的安全性评价，逐步不允许成员国从外国进口和销售进行动物试验的化妆品。但是在我国，动物试验替代方法的研究仍处于起步阶段，各类产品的皮肤安全性评价仍依赖传统的动物试验。
为建立与国际接轨、并符合我国目前研究水平和应用需求的化妆品毒理学安全性评价体系，提升我国突破化妆品国际贸易中技术壁垒的能力，2011年8月国家食品药品监督管理局启动了《化妆品动物试验替代方法体系研究》项目。为实现该项目的研究目标，由中检院、广东出入境检验检疫局、广东省疾病预防控制中心有关技术人员组成专家组，进行了实地调研和座谈，提出了我国《化妆品动物试验替代方法体系研究》的研究报告。由广东出入境检验检疫局技术中心开发的《采用嵌入式培养法制备毒性检验用器官型人工皮肤的方法》（申请号：200810029210.8），以及由广东检验检疫局程树军等人开发的《利用干细胞筏式培养制备毒性检验用全层皮肤的方法》（申请号：200810030387.x）均获得国家发明专利。
目前的报告都仅限于科学研究范畴，还没有相应的商品化产品及服务。2012年，北京富龙康泰生物技术有限公司的研究人员开发出种商品化的3D重组皮肤模型，可用来评估化合物对于皮肤的刺激性或者腐蚀性。据目前所知，这是中国最早商品化的皮肤模型之，具有类似于人类表皮的组织结构，且符合OECD的5条质量标准。该皮肤模型培养在24孔板中，可以检测所有剂型的化学物质，包括粉剂、液体和膏剂；用MTT和IL-1α双终点检测有效提高皮肤刺激性试验和腐蚀性试验的灵敏度、特异性和精确性。
人造重组皮肤模型有望代替动物模型，但是仍需要进步完善。特别针对中国地区人群皮肤特点的皮肤模型和商业产品开发几乎处于空白，研究者们仍面临巨大的挑战。
（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）再次更新试验指南TG43l和TG439，对于使用3D皮肤模型进行体外皮肤腐蚀性、刺激性试验，提出更具体的要求。本篇综述重点介绍由角质细胞构成的重组表皮模型（Reconstructed Human Epidermis Made of Keratinocyte，RHE），概述其检测原理，以及OECD对于应用此类体外模型的最新标准。简单介绍其他种类的皮肤模型，并对我国目前动物试验替代方法的研究成果和前景进行讨论和总结。
关键词：皮肤模型，动物试验替代方法，OECD规则
引言
皮肤作为人类最大的器官，包含多种类型的细胞，这些细胞相互影响，协同作用，构成阻挡有害物质进入机体的第一道天然屏障。角质层作为皮肤屏障作用的主要执行者，是由表皮层基底的角质细胞不断分化而来（如图1）。在表皮层中，除了角质细胞，还有黑色素细胞和朗罕氏细胞。表皮层通过一层基膜与其下面的真皮层相连接。真皮层分为乳突层和网状层，前者含有的胶原纤维排列疏松，后者的胶原纤维排列致密并且与皮肤表面平行。这些胶原纤维由成纤维细胞产生，含有大量的弹性蛋白，为皮肤提供弹性。不同于表皮层没有血管的结构，真皮层内富含血管、淋巴管、神经、汗腺、皮脂腺和毛囊。
皮肤的疾病可能由多种原因造成，比如细胞代谢紊乱、传染病，对外界抗原的免疫性反应或是物理性、化学性的伤害。病因的多样性和复杂性使得在药物研发领域，对于体外皮肤模型的需要日益增长。另外，出于法律和道德的要求，国外化妆品行业同样重视体外皮肤模型的使用。2013年7月26日，经济合作与发展组织（Organization for Economic Co-operation andDevelopment.OECD）再次更新试验指南TG431和TG439（以下简称2013版指南），对于体外皮肤腐蚀性、刺激性试验提出更详尽的要求。
大量的研究促使人类皮肤模型不断进步，从依靠滋养层培养到表皮替代物以及多种类型细胞共培养系统。目前皮肤模型主要分为两大类，一类是致力于开发更为精细复杂的皮肤模型，用于皮肤疾病的治疗，培养条件和结果判定也相应的更复杂。已经建立的比较好的模型是包含有角质细胞和成纤维细胞的全皮模型（fullthickness.FT），还有更为复杂的加入了其他类型细胞（如黑色素细胞，干细胞，朗罕氏细胞）或者可以与其他器官相互作用的模型。第二类则是已经进入量产并且经过验证的由角质细胞构成的重组表皮模型，主要用于风险评估，具有很好的可重复性。本文将重点讨论第二类皮肤模型，并简单介绍其他模型。
由角质细胞构成的重组表皮模型
1.概况
为满足研究者和工业界对于皮肤模型不同的需求，现有的皮肤模型有多种类型。最基本的是只含角质细胞的皮肤模型，即由角质细胞构成的重组表皮模型（Reconstructed HumanEpidermis Made of Keratinocyte.RHE）。RHE是在特定条件下培养人类角质细胞，并通过气液面培养的方式得到角质层，基本具有类似于人表皮的组织结构（如图2）。
1998年，首批皮肤模型（EpiSkin和EpiDermTM）被替代方法欧洲研究中心（EuropeanCentre for the Validation of AlternativeMethods.ECVAM）批准用于皮肤腐蚀性预测，并于2004年随着OECD试验指南的出版而在国际上被广泛接受。不久之后，其他满足经合组织试验指南要求的模型陆续被批准。2008年经过调整的EpiDerm SIT和SkinEthic被批准用于皮肤刺激性预测。
2.检测原理
RHE对于有潜在腐蚀性或刺激性物质的预测是通过检测细胞存活率的方法来实现。即待检测物质渗透至角质层以下的细胞层，如果对活细胞产生毒性作用，就会导致部分细胞死亡。使用3-（4.5-二甲基噻唑-2）-2.5二苯基四氮唑溴盐（简称MTT）检测，根据试验组吸光值（OD值）和阴性对照组的比值，确定细胞活率的变化。当待测物质对于活细胞有刺激作用时，细胞会分泌系列迅速引起皮肤炎症的因子，如IL-1α，对其定量分析可以辅助评估细胞受到刺激的程度和体外炎症起始的级联反应/作用机理。所以对于刺激性物质通常会选用MTT和IL-1α双终点判定。
3.OECD 2013版指南对于皮肤模型的基本要求
RHE主要目的是对待测物质进行毒性预测和评估，所以必须保证试验结果的可重复性。在2013版试验指南中，OECD提出了皮肤模型的“执行标准”（performance standard），规定如果向OECD申请认证新的或类似的皮肤模型，必须符合此“执行标准”。其中关于皮肤模型的质量制定了五项基本标准，概况如下：
1）细胞活性：每批次的RHE必须达到规定的阴性对照标准，即细胞活率达到特定数值。不同生产商标准有所不同，如表1，OD值过低，说明RHE自身活细胞数目少，活率低，可能无法真实反应待测物质的腐蚀性或刺激性；相反，如果OD值太高，说明RHE细胞数量过多，可能对于毒性有耐受，同样无法获得真实结果。
2）屏障作用：角质层及其脂质结构产生的屏障作用能够在一定程度上抵挡特定有害物质的快速渗透。一般使用SDS或者1%Triton-100作用于RHE表面，计算细胞活率下降50%所需要的时间（ET50）或者剂量（C50），两个值需在定范围内（如表2），过低或者过高表明角质层太薄或者太厚，都不能真实预测待检物质的毒性作用。 3）组织结构：必须具备人表皮样结构，即有基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层。
4）可重复性：阳性对照和阴性对照的试验结果必须具有可重复性。
5）质量控制：需要将以上四点信息告知使用者，并保证每个批次的RHE各项指标均在规定范围内。
另外，“执行标准”中针对皮肤腐蚀性/刺激性试验。分别提供了参考化学品名录（MinimumList of Reference Chemicals）。并且更改了腐蚀性试验化学品的分类方法，由之前分为两类（腐蚀性和非腐蚀性）改为三类（1A、1B-and-1C、和NC），1A代表强腐蚀性，1B-and-lC代表中等腐蚀性，NC代表非腐蚀性（如表3）。刺激性试验化学品依旧分为两大类——刺激性和非刺激性（如表4）。
4.OECD 2013版指南对于试验操作的基本要求
对于应用RHE进行皮肤刺激性或腐蚀性试验操作，2013版指南也提出具体要求，简单概括以下几点：
1）每个待测品有2～3个皮肤组织作为重复。
2）根据待测品性质和皮肤组织面积规定最少用量。
3）根据待测品种类选择2个或3个暴露时问，对于刺激性化学品，一般暴露60分钟，清洗再培养42小时后检测；对于腐蚀性化学品，一般选择3分钟和60分钟两个时间点。
4）阴性对照可选择生理盐水或磷酸盐缓冲液。
其他类型的重组皮肤模型
1.全皮模型（Full ThicKness，FT）
全皮模型通常包含有角质细胞、成纤维细胞以及胶原基质。通常是由胶原蛋白和人的皮肤成纤维细胞结合形成基质，然后将角质细胞培养于基质之上，同样经过气液面培养形成角质层。与表皮模型十分明确的培养条件不同的是，全皮模型的培养过程中加入血清（为了成纤维细胞的存活）。血清作为种天然产物，每批次的各种蛋白含量，如生长因子，都有可能不同，从而导致全皮模型批次问的差异。但是全皮模型的角质层屏障作用更强，得到的结果与体内试验致性更好。
2.含有色素细胞的皮肤模型
由Duval等建立的含有色素细胞的皮肤模型，是迄今为止最为完善的且在生理学上被证明的皮肤模型。尽管黑色素细胞是最早被研究者试图加入到皮肤模型中的细胞，但是因为角质细胞参与调解黑色素细胞的附着、存活和形态，所以经历了将近30年，研究者才得到令人满意的模型。含有色素细胞的皮肤模型，一方面将帮助制药企业研发治疗白癜风等疾病的药物；另方面，将对化妆品企业研发美白产品起到帮助作用。
3.含有朗罕氏细胞的皮肤模型
因为皮肤是抵挡外界侵害的屏障，所以它也是免疫反应多发的部位。表皮中有促炎作用和免疫调节作用的细胞包括：角质细胞、黑色素细胞和上皮的树突状细胞（又名为朗罕氏细胞）。目前，对于含有朗罕氏细胞的皮肤模型，都集中于器官型培养，用于皮炎治疗等方面的研究。
国内重组皮肤模型前景
尽管人类皮肤模型在国外已经有40多年的发展历史，并已经形成法律规范，欧盟化妆品规程第7次修正案（2003/15/EC.2003）中规定，自2009年3月起在欧盟范围内禁止使用动物进行化妆品毒性和过敏试验，2013年起禁止使用动物进行化妆品原料的安全性评价，逐步不允许成员国从外国进口和销售进行动物试验的化妆品。但是在我国，动物试验替代方法的研究仍处于起步阶段，各类产品的皮肤安全性评价仍依赖传统的动物试验。
为建立与国际接轨、并符合我国目前研究水平和应用需求的化妆品毒理学安全性评价体系，提升我国突破化妆品国际贸易中技术壁垒的能力，2011年8月国家食品药品监督管理局启动了《化妆品动物试验替代方法体系研究》项目。为实现该项目的研究目标，由中检院、广东出入境检验检疫局、广东省疾病预防控制中心有关技术人员组成专家组，进行了实地调研和座谈，提出了我国《化妆品动物试验替代方法体系研究》的研究报告。由广东出入境检验检疫局技术中心开发的《采用嵌入式培养法制备毒性检验用器官型人工皮肤的方法》（申请号：200810029210.8），以及由广东检验检疫局程树军等人开发的《利用干细胞筏式培养制备毒性检验用全层皮肤的方法》（申请号：200810030387.x）均获得国家发明专利。
目前的报告都仅限于科学研究范畴，还没有相应的商品化产品及服务。2012年，北京富龙康泰生物技术有限公司的研究人员开发出种商品化的3D重组皮肤模型，可用来评估化合物对于皮肤的刺激性或者腐蚀性。据目前所知，这是中国最早商品化的皮肤模型之，具有类似于人类表皮的组织结构，且符合OECD的5条质量标准。该皮肤模型培养在24孔板中，可以检测所有剂型的化学物质，包括粉剂、液体和膏剂；用MTT和IL-1α双终点检测有效提高皮肤刺激性试验和腐蚀性试验的灵敏度、特异性和精确性。
人造重组皮肤模型有望代替动物模型，但是仍需要进步完善。特别针对中国地区人群皮肤特点的皮肤模型和商业产品开发几乎处于空白，研究者们仍面临巨大的挑战。